苦參堿對肺結核大鼠結核桿菌及Ire1信號的作用及機制

王超 趙鵬 張競美

(青島市胸科醫(yī)院，山東 青島 266043)

肺結核是由結核分枝桿菌引發(fā)的肺部感染性疾病，臨床表現(xiàn)為盜汗、發(fā)熱、月經(jīng)失調(diào)、呼吸困難等癥狀，嚴重威脅人類的健康〔1〕。結核分枝桿菌簡稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中肺結核最為多見〔2〕。肺結核至今仍為重要的傳染病，有報道顯示，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病〔3〕。我國結核病患病人數(shù)高居世界第2位，肺結核處于高發(fā)狀態(tài)，因此肺結核疾病仍是臨床上治療的難題?？鄥槎箍评僦参锟鄥⒌母稍锔?，是中國歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一〔4〕?？鄥儆谇鍩嵩餄袼?，其性味苦寒，有清熱燥濕和利尿的功效〔5,6〕。近些年，國內(nèi)外對苦參的研究重點放在生物堿上，目前已經(jīng)從苦參中分離出27種生物堿?？鄥⑸飰A大多屬于喹諾里西啶類，極少數(shù)為雙哌啶類，以苦參生物堿和氧化苦參堿含量最高，并且苦參堿具有肝細胞保護、消炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒等多方面的藥理活性〔7,8〕?？鄥⑺啬z囊在肺結核治療中具有良好的保肝作用，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好地治療肺結核〔9〕。肌醇必需酶(IRE)1是存在于內(nèi)質網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，哺乳動物中存在IRE1α和IRE1β兩種亞型，IRE1α在哺乳動物所有的組織細胞中普遍存在，而IRE1β則存在于呼吸道、胃腸道消化系統(tǒng)的上皮細胞中〔10〕。IRE1α在不同的組織細胞中表達也大不相同，目前還沒有明確報道證實IRE1α在肺結核肺組織中的表達情況，因此本文建立肺結核大鼠模型，并給予苦參堿治療干預，觀察苦參堿對肺結核大鼠結核桿菌的抑制作用及其對IRE1信號的表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 大鼠均來中國科學院上海實驗動物中心，共計60只健康大鼠，體重平均(221.5±1.4)g，正常飼養(yǎng)，保證實驗室清潔，晝夜交換更替，保持實驗室溫度在24℃。

1.2試劑和儀器 苦參堿(上海第二軍醫(yī)大學藥學院中西藥研究室)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、一抗二抗去除液(強堿性)、細胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、IRE1抗體均購自沈陽萬科生物科技有限公司；低溫高速離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)；成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；多功能電泳儀購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責任公司。

1.3動物分組與模型建立 大鼠隨機分為正常組、PTB組和Mat組，每組20只。正常組大鼠尾靜脈注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。PTB組和Mat組大鼠尾靜脈注射由結核患者痰液中分離的結核分枝桿菌，該桿菌已按結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程驗證為結核分枝桿菌，取分裂旺盛的模型菌，用 0.9%氯化鈉溶液溶解，每只大鼠注射0.2 ml細菌懸液。

造模成功后，正常組和PTB組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃干預；Mat組大鼠給予苦參堿灌胃，每千克大鼠給予30 mg進行干預，3組大鼠給藥干預1次/d，連續(xù)干預30 d。

1.4標本采集 檢測各組大鼠給藥后第1天、15天和30天體重變化。造模30 d時，用頸部脫臼法分別處死3組大鼠，留取肺組織，放置在-80℃的冰箱中保存，以用于后續(xù)實驗。

1.5測定大鼠體重 在給藥后1 d、15 d和30 d時，分別對正常組、PTB組和Mat組大鼠的體重進行測量并比較。

1.6大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù) 取每只大鼠全部左肺組織，加入2 ml 0.9%氯化鈉注射液后研磨成勻漿，再取組織液加等體積4%硫酸消化15 min 后，加入2.5 mol NaOH調(diào)整至pH7.0左右，接種于斜面培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)5 w，計數(shù)培養(yǎng)基上結核分枝桿菌菌落數(shù)。

1.7肺組織病理學形態(tài)觀察 分別取出正常組、PTB組和Mat組大鼠的肺組織取出，固定后用石蠟進行包埋處理，把包埋后的組織進行切片，每個切片組織均為5 μm，切片組織脫蠟后，用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察。用顯微鏡對染色的肺組織進行觀察，觀察組織形態(tài)的變化。

1.8Western印跡法檢測肺組織中Ire1α和GRP78蛋白的表達 3組大鼠的肺組織分別提取100 mg，細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。電泳板孔內(nèi)注入蛋白樣品，50 μg。轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脫脂奶粉，封閉1 h。TTBS洗滌要在加入的1抗前進行，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進行稀釋，再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后數(shù)碼相機照相。

1.9qRT-PCR法檢測肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA的表達 分別取出3組大鼠的肺組織，用Trizol將組織進行裂解，對總的DNA進行提取，所有的逆轉錄反應按照說明書進行，經(jīng)所得到的cDNA進行熒光實驗。反應按照反應條件嚴格進行擴增，變性30 s 95℃，變性5 s 95℃，退火40 s 60℃，一共45個循環(huán)。取平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗、單組間因素分析。

2 結 果

2.13組大鼠體重比較 給藥后1 d 3組大鼠的體重變化沒有顯著差異(P>0.05)。給藥后15 d和30 d，與正常組體重相比，PTB、Mat組體重顯著降低(P<0.05)；給藥后15、30 d，Mat組體重明顯高于PTB組(P<0.05)，見表2。

2.23組肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù)比較 正常組肺組織中沒有結核分枝桿菌的菌落出現(xiàn)，和正常組大鼠相比，PTB組大鼠的肺組織中結核分枝桿菌的菌落數(shù)量顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中結核桿菌的菌落數(shù)量顯著低于PTB組(P<0.05)，見表3。

2.3肺組織病理變化比較 正常組肺組織沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。與正常組相比較，PTB組大鼠肺臟血管周圍有大量的炎性細胞浸出，并且出現(xiàn)了大量的肉芽腫樣細胞聚集；肺間質之間出現(xiàn)了大量的水腫，大體解剖可見肺臟表面存在白色栗粒狀結節(jié)。Mat組肺組織病理情況明顯好于PTB組，見圖1。

表2 3組給藥后1 d、15 d和30 d體重比較

表3 3組肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù)及IRE1α、 GRP78蛋白表達比較

圖1 3組肺組織(HE染色，×100)

2.43組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達比較 與正常組相比，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達明顯低于PTB組(P<0.05)，見表3、圖2。

圖2 3組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達

2.53組肺組織中IRE1α 和GRP78 mRNA表達比較 與正常組相比較，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Mat組肺組織中的IRE1α和GRP78 mRNA表達低于PTB組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 3組肺組織中IRE1α、GRP78 mRNA 表達比較

3 討 論

肺結核屬于慢性呼吸傳染疾病，主要由結核分枝桿菌感染肺部導致機體免疫應答紊亂引起，患者可通過呼吸及咳嗽產(chǎn)生飛沫或痰液傳播，影響社會健康〔11〕。肺結核病程長，病理變化復雜，臨床表現(xiàn)為機體細胞因子分泌失衡、腫瘤壞死因子釋放過多等癥狀，導致患者呼吸系統(tǒng)功能異?！?2〕，嚴重者會導致肺部空洞，故疾病早期予以良好治療意義重大。苦參堿是從中藥苦豆子中分離出來的單體生物堿，具有提高免疫力、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面的藥性活性和臨床用途〔13〕。有研究結果證實，苦參堿在結核桿菌標準珠H37RV濃度為104CFV/ml時，MIC值為10 mg/L，和傳統(tǒng)的方法相比效果更為顯著，由此說明苦參堿有抑制結核桿菌生長的作用〔14〕。IRE1α具有復雜的結構和功能，是目前報道的蛋白中唯一一個同時具有激酶和核酸內(nèi)切酶活性的蛋白〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α能通過多種途徑誘導細胞凋亡和參與炎癥反應，并且介導著代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展〔16〕，但目前還沒有實驗證明IRE1α在肺結核中具體表達，因此本文給予肺結核大鼠苦參堿進行干預治療，證實其對肺結核結核桿菌的抑制作用，并觀察苦參堿對肺結核大鼠肺組織中IRE1α蛋白表達的影響。

本文建立肺結核大鼠模型，實驗結果顯示經(jīng)過苦參堿治療后大鼠的體重明顯回升，并且大鼠狀態(tài)也得到了改善，可見苦參堿可有效改善肺結核大鼠的癥狀。結核分枝桿菌菌落計數(shù)可直接反映肺結核病的嚴重程度，本研究結果說明，苦參堿治療以后，患病大鼠的病癥明顯減輕，結核治療效果明顯?？鄥A有降低DNA含量的功能，這可能是其抑制結核桿菌生長的作用之一。吳濤等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)檢測苦參堿藥物高低濃度時，有70%在抑菌濃度范圍內(nèi)，還有23%為高低濃度生長菌，可能是結核桿菌的耐藥株，其對大多數(shù)抗生素有一定抵抗能力，還有2株為高低濃度敏感株，可能比較脆弱的結核桿菌株存在。連續(xù)培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)高低濃度的生長菌比例明顯上升，說明苦參堿有顯著的抑菌作用，雖然不能殺死全部的結核桿菌，但能有效減緩細菌的生長速度。

在治療抗結核的藥物中均有不同程度的肝細胞毒性，治療結合病中經(jīng)常伴隨著肝細胞的損傷，而肝細胞的損傷往往伴隨著細胞的過度凋亡、而細胞凋亡最主要的途徑就是內(nèi)質網(wǎng)應激，有研究表明，內(nèi)質網(wǎng)應激是肺結核發(fā)生發(fā)展的重要病理機制。IRE1信號通路是內(nèi)質網(wǎng)應激信號通路中的經(jīng)典通路，被認為與慢性疾病引起的細胞凋亡有關〔18〕。當內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生時，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的解離促進了IRE1α的激活，驅動多種未折疊的蛋白應答相關的基因表達，從而誘發(fā)細胞凋亡〔19〕。GRP78又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白，當內(nèi)質網(wǎng)應激時對受到刺激的細胞最先進行保護，被稱為內(nèi)質網(wǎng)應激途徑的關鍵標志性因子。本研究結果提示，苦參堿能有效抑制肺結核肺組織中IRE1α和GRP78的表達。有研究者把肺結核患者隨機分為治療組和對照組，治療組患者給予苦參素膠囊干預，結果顯示治療組患者均未出現(xiàn)肝功能損傷，而對照組有1/3患者肝功能受到嚴重損傷〔20〕，說明苦參素膠囊在肺結核化療中同時具有較高的保肝效果，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好的治療肺結核。王捷等〔21〕通過對肺動脈損傷的大鼠研究證實，在模型組大鼠肺組織中IRE1信號通路中關鍵因子IRE1α和GRP78均顯著升高，藥物治療后發(fā)現(xiàn)其表達得到了顯著的抑制，進而降低肺動脈的壓力，為肺動脈損傷的靶向治療提供新的途徑。

綜上，苦參堿可有效抑制肺結核結核桿菌的生長，同時對肺組織中IRE1α信號通路進行抑制，進而對肺組織進行保護。