納米抗體靶向肺癌診療的研究進展①

肖宇辰 吉日木圖 郭文婕 伊 麗

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

據(jù)《2020年癌癥統(tǒng)計》，全球范圍內(nèi)肺癌是發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，約占腫瘤病死率的18%。2018年，中國新發(fā)癌癥約428萬例，其中肺癌、胃癌、肝癌等占總數(shù)的58.6%［1］。肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），治療手段有手術(shù)、放療、化療和靶向治療［2］。近年免疫治療是肺癌診療的研究熱點，是必不可缺的組成部分。

20世紀90年代以來，研究者相繼在單峰駝、雙峰駝、羊駝等血清中發(fā)現(xiàn)，除含IgG1（170 kD）外，還存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chain antibodies，HCAbs）IgG2和IgG3（100 kD）［3-10］。重鏈抗體包含 2個恒定區(qū)（CH2和CH3）、1個鉸鏈區(qū)及1個重鏈可變區(qū)（variable heavy chain domain，VHH）。VHH抗體又稱為納米抗體（nanobody，Nb），分子量僅為傳統(tǒng)抗體的10%，保留了HCAbs完整的抗原結(jié)合力，特異性強、親和性好、穩(wěn)定性高，廣泛用于生化機制研究、結(jié)構(gòu)生物學及腫瘤等疾病診療［11］。Nb偶聯(lián)放射性核素可作為腫瘤活體成像的示蹤劑，快速有效地穿透至腫瘤組織，增強成像信號［12］。此外，Nb多被設(shè)計為多價或多特異性結(jié)構(gòu)，可特異性結(jié)合蛋白表面空腔，也可與信號序列相連，利用細菌或相關(guān)受體通路在腫瘤細胞內(nèi)進行靶向遞送［13-16］。Nb優(yōu)越的成藥特性使其在癌癥診療等方面具有良好前景。

早期診斷與靶向治療一直是抗腫瘤重點，其關(guān)鍵在于最大程度減少對正常組織的損傷，同時快速準確地將藥物滲透至病灶，對滲透性及親和性提出了更高要求。Nb因其獨有特性成為抗腫瘤的最佳選擇。

1 Nb的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 Nb結(jié)構(gòu)特征 常規(guī)抗體IgG由2條重鏈（heavy chain，H鏈，50～75 kD）和2條輕鏈（light chain，L鏈，25 kD），通過非共價鍵與二硫鍵相互連接形成一個“Y”型四肽鏈結(jié)構(gòu)（150 kD）（圖1）［17］。H鏈由恒定區(qū)（CH1、CH2、CH3）和可變區(qū)（VH）組成，L鏈包含恒定區(qū)（CL）和可變區(qū)（VL）。與傳統(tǒng)IgG相比，HCAb缺少L鏈和H鏈CH1，僅含H鏈CH2、CH3和VHH。

圖1 常規(guī)抗體IgG1、HCAbs結(jié)構(gòu)示意圖［10］Fig.1 Schematic structure of conventional IgG and HCAbs［10］

Nb是目前已知可與抗原結(jié)合的最小片段，單鏈抗體分子量約30 kD，而Nb分子量約15 kD，是常規(guī)抗體的10%。駝源VHH與人源抗體VH結(jié)構(gòu)相似（圖2），均包含互補決定區(qū)（CDR1、CDR2、CDR3）和骨架區(qū)（FR1、FR2、FR3、FR4）。VHH胚系基因與人類VH3家族序列同源性達80%～90%，區(qū)別在于VHH的CDR1和CDR3長于人類［18］。相較于常規(guī)抗體，VHH的CDR3結(jié)構(gòu)呈凸型，抗原特異性結(jié)合力更強，輕鏈缺失并未影響其抗原結(jié)合力。雖僅含3個CDR，但Nb具有完整的抗原結(jié)合片段，特異性強、親和力高。駱駝科動物的VHH基因在維系正常HCAb功能的幾個重要位點處存在選擇性進化。常規(guī)抗體VH區(qū)的FR2區(qū)中，4個氨基酸殘基（V37、G44、L45、W47）與VL區(qū)相互作用，而在HCAb中，這些疏水性氨基酸殘基則特征性突變?yōu)橛H水性殘基 F（Y）37、E44、R45、G47（圖2），使VHH的親水性增強，加上其內(nèi)部的二硫鍵，無需與VL形成二聚體即可維持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)［19］。此外，駱駝HCAbs不含CH1區(qū)，但CH1區(qū)序列存在于H鏈胚系基因序列，經(jīng)翻譯重組后，編碼可變區(qū)mRNA缺失，可能源于該基因重排時經(jīng)歷了剪切作用。此外，H鏈CH1區(qū)的氨基酸序列可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中免疫球蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抗體產(chǎn)生，也是加快CH1區(qū)缺失的原因。而CH1區(qū)缺失后，鉸鏈區(qū)則直接連接HCAbs的可變區(qū)和恒定區(qū)。

圖2 VHH與VH結(jié)構(gòu)差異［4］Fig.2 Structure differences between VHH and VH［4］

1.2 Nb的功能特征

1.2.1 溶解性高、穩(wěn)定性強 常規(guī)抗體VH暴露的疏水域彼此黏附，而VHH的FR2框架區(qū)4個親水氨基酸替代疏水氨基酸，增強了水溶性，降低了聚合性。VHH的穩(wěn)定性源自內(nèi)部多個二硫鍵，耐熱性強，常溫下易儲存使用，37 ℃放置1周后，VHH仍可保持80%以上活性［20-21］。此外，VHH在強變性劑條件下也顯示出較高的耐受性，高于90 ℃可長期保存，恢復室溫后易復性并重獲生物活性［22］。

1.2.2 靶向性和穿透力強 VHH較長的CDR3凸型結(jié)構(gòu)可深入抗原內(nèi)部更好地與抗原結(jié)合。VHH FR2區(qū)的親水氨基酸替代了輕鏈缺失引發(fā)的抗原結(jié)合力下降，穿透力更好，可進入腫瘤組織發(fā)揮功效。此外，Nb還可有效穿透血腦屏障，為治療阿爾茨海默病和帕金森綜合征等腦部疾病提供了新途徑［23-25］。

1.2.3 免疫原性弱，易人源化 傳統(tǒng)抗體在治療時會產(chǎn)生免疫原性，觸發(fā)強烈免疫應答。VHH的分子量小，僅為常規(guī)抗體的1/10，結(jié)構(gòu)簡單，僅含1個結(jié)構(gòu)域，可避免Fc片段引起的補體反應。此外，VHH與人VH區(qū)同源性高（＞80%），依據(jù)兩者氨基酸差異可對駝源VHH中的12個氨基酸殘基進行人源化修飾，降低VHH抗體作為治療藥物的免疫原性［18］。

1.2.4 易生產(chǎn) VHH可由單個基因編碼，在各種蛋白表達系統(tǒng)中高表達（圖3），即使以包涵體形式表達也易復性［26-28］。常規(guī)條件下，VHH在大腸桿菌中表達量為5～10 mg/L，酵母表達體系或優(yōu)化條件下表達量更高［3］。

圖3 駝源VHH抗體制備流程Fig.3 Preparation process of camelid VHH antibody

2 Nb在肺癌診斷中的作用

Nb分子小、穿透力強，可高效滲透至靶標，且血液清除速度快、特異性高、親和力高，常被作為靶向示蹤分子用于特異性放射顯像或靶向超聲造影，憑以上特性偶聯(lián)不同標志分子，并聯(lián)合PET、SPECT、超聲或光學成像等技術(shù)，實現(xiàn)以Nb為基礎(chǔ)的病灶組織特異靶向示蹤，實現(xiàn)腫瘤快速、靈敏、定量診斷，大大提高診斷水平，將成為成像領(lǐng)域重要研究方向。近年取得進展見表1。

表1 Nb用于癌癥診斷劑Tab.1 Application of Nb in cancer diagnostic agents

當前，Nb偶聯(lián)放射性同位素或熒光標志物可實時監(jiān)測癌細胞等。臨床常用放射性核素99mTc偶聯(lián)Nb示蹤疾病。99mTc標記的anti-EGFR-Nb腫瘤攝取高，體內(nèi)半衰期僅為1.5 h，可用于肺癌免疫治療與放射顯像［29-30］。99mTc-RGD-GE11@USPIO可同時富集于EGFR和αvβ3均高表達的肺癌H1299腫瘤部位，靶向性好，結(jié)合率高，T2造影效果顯著，具有SPECT/MRI雙模成像效果［31］。99mTc-EGFR Nb五聚體可高效結(jié)合并顯影多種EGFR+癌細胞，作為一種新型分子探針用于癌癥放射診斷［32］。scFv@GoldMag可與EGFR+肺癌細胞特異性結(jié)合并內(nèi)化，有望成為MRI分子探針［33］。納米分子探針anti-EGFR-PEG-SPIO具有超聲磁性效應、靶向高表達EGFR癌細胞等特點，有潛力成為MR分子探針［34］。而利用Uni CAR-T細胞和腫瘤特異性靶模塊（TM）生成二價α-EGFREGFRTM，擁有強大的EGFR親和力，可將其重定向至EGFRlow腫瘤細胞，增加細胞因子釋放和腫瘤排斥反應，促進雙特異性CAR-T細胞生成，進而示蹤EGFR 低表達的肺癌細胞［37］。

以HER2為靶點的Nb偶聯(lián)68Ga在PET/CT顯像中安全性較高，生物分布較快，可媲美常規(guī)PET示蹤劑［39］。Nb-2Rs15d可與99mTc、177Lu、18F等偶聯(lián)，快速、特異、高對比度示蹤HER2過表達腫瘤組織，而與α-發(fā)射體225Ac偶聯(lián)可最小程度暴露周圍健康組織，向靶細胞提供高致死性和局部輻射［40-43］。125I-Nb和131IB-Mal-DGEEEK-Nb對BT474M1細胞均具有較好親和力，131IB-Mal-DGEEEK-Nb腫瘤攝取高于125I-Nb，脫碘現(xiàn)象明顯減少，具有靶向診療肺癌的潛力［44］。而具有良好親和特異性及親和強度的anti-HER2-Nb五聚體為NSCLC治療提供了新的可能。99mTc標記的抗巨噬細胞甘露糖受體（macrophage mannose receptor，MMR）Nb可快速定位至過表達MMR的肺癌組織，具有高腫瘤組織特異性，而將其構(gòu)建為多價Nb可增強特異性，縮短體內(nèi)半衰期［45］。99mTc-anti-PD-L1 Nb可快速特異性濃聚于高表達PD-L1的NSCLC，并在1～2 h內(nèi)獲得有效顯像，靶本比高，輻射劑量低，具有成為方便、快捷，有效新型顯像劑的潛力［46］。

3 Nb在肺癌治療中的潛在作用

近年傳統(tǒng)抗體是臨床靶向肺癌治療的主要方法之一，但其分子量高達150×103，穿透力差，有時難以到達靶組織。而Nb憑借獨特優(yōu)勢：特異性作用于某些過表達組織，有效干預其分子調(diào)控及腫瘤信號轉(zhuǎn)導，腫瘤治療。目前針對肺癌靶點的Nb主要包括anti-EGFR Nb、anti-HER2 Nb、anti-VEGF Nb、anti-CD47 Nb、anti-CD147 Nb等。

3.1 靶向PD-1/PD-L1的Nb 程序性死亡受體1（PD-1）是T細胞表達的重要免疫抑制分子。PD-L1 為Ⅰ型跨膜糖蛋白，可表達于B細胞、T細胞、樹突狀細胞等，也廣泛表達于NSCLC等腫瘤細胞。PD-1與PD-L1屬于同一對T細胞負性共刺激分子，二者相互作用可產(chǎn)生免疫負應答，形成負腫瘤微環(huán)境，導致腫瘤免疫逃逸。PD-L1高表達于肺癌組織（61.67%），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤細胞分化程度等相關(guān)，可成為判斷NSCLC病情發(fā)展及預后的有效指標。Anti-PD-1/PD-L1藥物主要通過阻遏T細胞的PD-1與腫瘤細胞的PD-L1結(jié)合，削弱PD-1介導的抑制作用，促使免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，目前國外已上市Tecentiq、Imfinzi和Bavencio等PD-L1抗體藥物，anti-PD-L1 Nb KN035對NSCLC等腫瘤治療效果顯著［47］。

Anti-PD-1 Nb可有效識別位于PD-1相互作用界面的β環(huán)，顯著抑制PD-1結(jié)合至靶細胞表面的PD-L1。KN035是二價的anti-PD-L1 Nb-Fc融合物，與Durvalumab（FDA批準的anti-PD-L1 IgG1κ）具有同等活化CD4+T細胞及抑制癌細胞生長的作用，可聯(lián)合NK細胞介導ADCC作用殺傷癌細胞，與已知的FcγRs參與加強anti-PD-L1抗體抗癌活性有關(guān)，具有靶向治療肺癌的潛力［47］。雙靶向Nb團簇體系（PEIRTX-AZL）利用anti-CD20-Nb特異性靶向腫瘤細胞，anti-PD-L1 Nb阻遏PD-1/PD-L1信號通路，恢復CTL細胞的抗腫瘤活性，協(xié)同增強增殖抑制、ADCC和PCD作用，大大提高其肺癌治療效果［48］。此外，Nb還可靶向免疫細胞和癌細胞，并重塑腫瘤環(huán)境。Anti-PD-L1 Nb修飾的脂質(zhì)體可將抗腫瘤藥物吉非替尼（Gefitinib）和辛伐他?。⊿V）傳遞至NSCLC內(nèi)皮細胞及M2樣巨噬細胞，且對Gef、SV耐藥細胞具有較強的抗腫瘤作用［49-50］。目前已成功構(gòu)建anti-PD-1/ PD-L Nb，無疑為NSCLC治療提供了一種新藥物，使靶向治療肺癌又前進一步。

3.2 靶向EGFR的Nb EGFR在NSCLC中陽性表達比例為45%～85%，且在正常組織、癌旁組織、癌組織中表達遞增。EGFR異常激活時會導致細胞過度分裂，促血管生成，抑制細胞凋亡。因此，EGFR表達可作為肺癌檢測指標，而靶向EGFR的藥物也是肺癌治療的新熱點。

目前，anti-EGFR Nb常作為拮抗劑競爭性識別結(jié)合高表達EGFR的肺癌細胞，阻滯其信號轉(zhuǎn)導，抑制肺癌細胞增殖、遷移活性，并誘導其凋亡，具有良好的應用前景。anti-EGFR Nb的多價形式可一定程度克服信號通路抑制劑的獲得性抗性，具有更高抗腫瘤效力［51］。anti-EGFR Nb偶聯(lián)anti-HER2的親和配體affibody的多價抗體MaAbNA（29 kD）可將低表達EGFR1和Her2的細胞毒性降至最低，同時抑制過表達EGFR1和Her2的肺癌細胞［52］；融合腫瘤特異性結(jié)合肽iRGD后可獲得具有高抗腫瘤效力和高腫瘤組織滲透率的重組蛋白anti-EGFR-iRGD，為肺癌診療提供了新的思路［53］。雙特異性輕型T細胞銜接子（LiTE）體積小、親和力強、穿透力強，可通過 連續(xù)注射用于肺癌治療及基因遞送，進一步結(jié)合 4-1BB scFv-TIE-EGFR Nb鏈形成雙特異性三價 4-1BB×EGFR構(gòu)建體，可精準定位腫瘤，顯著降低靶外細胞毒性，有效治療肺癌［54-56］。雙特異性抗體可同時觸發(fā)Vγ9Vδ2-T細胞及EGFR+癌細胞系的體外細胞毒性作用，減輕腫瘤負荷并提高存活率，可用于靶向肺癌治療［57-58］。而Transbody的強細胞穿透力可胞內(nèi)干擾EGFR-TKI結(jié)構(gòu)域激酶活性，抑制胞內(nèi)信號傳導，進而治療EGFR過表達肺癌［59］。

鑒于EGF與EGFR的親和力最高，anti-EGF Nb直接與受體競爭結(jié)合EGF，破壞內(nèi)源性EGF-EGFR相互作用，而激活EGF抑制劑，阻遏EGFR致癌途徑，具有靶向診治肺癌的潛力［60］。目前第一種EGF治療性疫苗Cimavax已通過臨床試驗，可顯著提高肺癌患者存活率。

此外，Anti-EGFR Nb可作為載體攜帶細胞毒藥物或裝載激酶的抑制劑，直接靶向EGFR+的癌細胞，顯著抑制其增殖、遷移，發(fā)揮治療效果［61-65］。以Nb作為藥物傳遞系統(tǒng)避免了普通給藥方式的毒性反應，將疏水性藥物以親水結(jié)構(gòu)進行運輸避免了多次給藥產(chǎn)生的免疫原性，在遏制腫瘤生長同時協(xié)同其他藥物發(fā)揮療效，為診治高表達EGFR的肺癌提供了新思路。

3.3 靶向Her2的Nb 人類表皮生長因子受體2（Her2）是Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，常過表達于中晚期肺癌，尤其是肺腺癌，可作為預后評估指標［66］。Her2過表達的肺癌對放療不敏感，對化療也產(chǎn)生耐藥性，而anti-Her2 McAb可抑制Her2過表達的肺癌細胞株生長，增強對化療的敏感性，人為干預Her2過表達有利于治療晚期肺癌［67］。

目前，研究者正在積極獲得具有Her2抗原親和性的VHH抗體，為開發(fā)一種新的效價高、副作用小、成本低的肺癌靶向抗體藥物提供可能［68］。對Her2和效應細胞FcγRⅢa的表位具有特異性及高親和力的Her2 bsFab可對Her2low腫瘤顯示出強大抗癌活性，同時避免了曲妥珠單抗及Fc相關(guān)局限性，提高了腫瘤免疫療法的適用性［69］。而將anti-Her2 Nb與其他靶點IgG的Fab、Fc片段或scFv融合得到的特異性分子不僅保留了IgG的血清半衰期和效應子功能，還增強了穿透性，具有強烈體外細胞毒性和體內(nèi)腫瘤生長抑制效果［70-72］。此外，雙特異性Her2×CD20 CAR將雙Nb串聯(lián)用作抗原識別結(jié)構(gòu)域，可同時識別CD20或Her2細胞，通過丟失腫瘤抗原降低腫瘤逃逸風險，提高了靶向準確性［73］。anti-Her2 Nb作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD）偶聯(lián)作為抗體募集結(jié)構(gòu)域（ARD）的二硝基苯酚基（DNP），可同時結(jié)合人血清0.8%的IgG1及Her2+腫瘤細胞，從而募集DNP特異性IgG1血清抗體，借助FcγRⅢ誘發(fā)NK細胞介導的ADCC作用，殺傷癌細胞［74］。

3.4 靶向VEGF的Nb VEGF是參與腫瘤血管發(fā)生的關(guān)鍵因素，在NSCLC中高表達（54%），可促進肺癌細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響NSCLC術(shù)后生存率和無瘤生存期，因而VEGF是NSCLC靶向治療的重要靶點。

目前，對人/鼠源VEGF具有高特異性及親和力的Nb主要通過阻遏VEGF顯著抑制體外人內(nèi)皮細胞遷移，以劑量依賴方式顯著抑制體內(nèi)肺上皮腫瘤細胞（TC-1）生長，提高存活率［75-78］。另外，VEGF抗體可阻遏VEGF與受體結(jié)合，抑制腫瘤新生血管形成。血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）與假單胞菌外毒素A共軛復合物和主要組織相容性復合體（MHCⅡ）與小分子微管抑制劑（DMⅠ）共軛復合物，皆可增強Nb對腫瘤組織的滲透力，有效抵達腫瘤部位，并特異性發(fā)揮抑制作用［79-80］。而與人IgG1抗體Fc片段融合的fusionbody則通過Nb與細胞表面VEGFR2結(jié)合，利用細胞凋亡和補體依賴性細胞毒性（CDC）殺死靶細胞［81］。

此外，偶聯(lián)富含脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸（PAS）的序列既可保持anti-VEGFA Nb生物學活性，又可顯著改善其分子大小、流體動力學半徑、溶解度及半衰期，為新型抗癌藥物開發(fā)開辟了新途徑［82］。

3.5 靶向CD47/CD147的Nb CD47又稱整聯(lián)相關(guān)蛋白（IAP），可結(jié)合源自骨髓的固有免疫細胞，尤其是巨噬細胞表面免疫負調(diào)節(jié)分子——信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）遏制巨噬細胞吞噬作用。CD47在諸多腫瘤中過表達，是腫瘤逃避免疫攻擊的機制之一。anti-CD47 Nb可競爭性阻遏CD47結(jié)合SIRPα，并介導巨噬細胞發(fā)揮作用，靶向殺傷NSCLC等實體瘤細胞，為腫瘤免疫治療提供了新方案［83］。而以恢復巨噬細胞介導吞噬作用的anti-CD47 Nb在體內(nèi)僅與抗PD-L1結(jié)合后才產(chǎn)生抗腫瘤活性［84］。由于CD47的普遍表達，阻遏CD47的關(guān)鍵在于健康細胞毒性（貧血）和抗原沉降，因此，CD47療法是解決腫瘤部位的抗體以降低毒性，利用基因工程改造B16細胞系用于在腫瘤微環(huán)境中表達anti-CD47 Nb，可同時解決抗原庫和Nb內(nèi)在的低半衰期問題，為癌癥治療提供了新依據(jù)［85］。

CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，高表達于肺癌等惡性腫瘤組織［86］。CD147能夠調(diào)節(jié)MMP分泌，控制癌細胞遷移、侵襲，可作為NSCLC的生物標志物。HcHAb18是一種人源化修飾型嵌合IgG單抗，易結(jié)合Fc受體，進而增強其ADCC效應，現(xiàn)已進入NSCLC一期臨床試驗［87］；而anti-CD147 Nb（11-1）可引起血液中趨化因子含量升高，間接發(fā)揮抗腫瘤效力，進一步偶聯(lián)阿霉素后會引起腫瘤細胞凋亡或壞死，為肺癌診療提供了新手段［88］。目前針對肺癌靶點的Nb如表2所示。

表2 Nb用于肺癌治療劑Tab.2 Application of Nb in lung cancer therapeutics

4 展望

Nb已在肺癌診療中展示出廣闊前景，但仍存在一些問題：①非免疫天然VHH文庫不易篩選到高特異性Nb，而獲得特異性Nb的動物免疫費用高，篩選過程復雜；②Nb因缺失Fc片段而缺乏ADCC和CDC功能；③用于腫瘤診療的靶標多位于細胞內(nèi)，需體內(nèi)轉(zhuǎn)染介導內(nèi)源性Nb表達，轉(zhuǎn)染率較低；④駝源Nb在人體內(nèi)免疫應答程度需確定。針對上述問題，可采取以下辦法：①分子克隆技術(shù)及噬菌體展示技術(shù)優(yōu)化將促進Nb文庫構(gòu)建及特異性Nb篩選；②人源化修飾Nb可降低其免疫原性，減少免疫應答，同時與人源IgG Fc片段嵌合，增加其ADCC和CDC功能。Nb不僅在腫瘤示蹤檢測中發(fā)揮重要作用，也將在替代傳統(tǒng)靶向抗體藥物、ADC藥物、口服抗體藥物、融合蛋白、腫瘤局部干預治療等方面實現(xiàn)新突破。

肺癌產(chǎn)生和發(fā)展是一個多基因、多階段的動態(tài)演變過程，其信號傳導機制又是一個多因素交叉復合的體系，構(gòu)建多靶點納米復合抗體或多靶點聯(lián)合用藥將為肺癌診療帶來新的視角，發(fā)揮更好療效。隨著對人類基因組學、生物化學及Nb的深入探索，更多有效的肺癌治療靶點將被發(fā)現(xiàn)，進而構(gòu)建更多、更高效的特異性Nb，從而推動Nb靶向肺癌診療步入新階段。