抗阿爾茨海默病重組腺相關(guān)病毒的制備與活性研究①

張 宇 王迪齊 付 璐 （吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種漸行性神經(jīng)退行性疾病，是世界上最常見的癡呆形式之一［1-2］。預計到2050年，世界患病人數(shù)將達到15 200萬例［3］。面對如此嚴峻的形勢，目前尚無藥物可有效治愈AD［4］。最新研究表明，高度磷酸化的微管結(jié)合蛋白即Tau蛋白（phosphorylated Tau，p-Tau）可能是AD的主要致病物質(zhì)之一［5］。Tau蛋白的高度磷酸化使其喪失了基本生理功能，導致細胞骨架結(jié)構(gòu)變化，使神經(jīng)元突觸功能喪失并發(fā)生神經(jīng)元的退行性病變，從而導致AD發(fā)生［6-7］。因此，利用免疫療法清除腦中的p-Tau有望成為治療AD的有效手段之一。

2011年，BOUTAJANGOUT等［8］首次報道了以p-Tau蛋白為靶點的AD被動免疫療法，該研究利用能夠識別Tau蛋白磷酸化Ser396/Ser404殘基的抗體對AD模型鼠進行免疫，可減少小鼠腦中Tau蛋白沉積，并且能夠延緩小鼠運動機能障礙。1985年BINDER等［9］通過收集BALB/c小鼠腹水制備了AT8單克隆抗體，該抗體可與牛和大鼠腦中p-Tau結(jié)合。1992年BIERNAT等［10］研究發(fā)現(xiàn)AT8單克隆抗體可識別AD致病性p-Tau的所有亞型。隨后的眾多研究表明AT8單克隆抗體可有效識別ser202和thr205位點［11-13］。因此，AT8成為潛在的治療AD的抗體藥物，并被廣泛研究。雖然靶向p-Tau的免疫療法已經(jīng)取得了一定進展，但依舊存在一些問題。如治療型全抗體的相對分子質(zhì)量較大，難以透過血腦屏障，很難直接作用于腦內(nèi)致病物質(zhì)，治療效果有限。此外，抗體的半衰期較短，AD的治療需要進行長期頻繁的抗體注射，降低了患者的順應性。因此，本研究以AT8為基礎(chǔ)，設(shè)計新型的AD免疫療法。

單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）是一種基因工程抗體，只含有抗體重鏈及輕鏈的可變區(qū)［14］。由于其相對分子質(zhì)量較小，相比于全抗體，能夠更好地透過血腦屏障，在AD治療領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus， AAV）是一種小型無包膜病毒，由于其安全性好、免疫原性低、在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，成為應用較為廣泛的基因治療載體之一［15-16］。其中，8型腺相關(guān)病毒具有感染范圍廣、轉(zhuǎn)導效率高的特點，是外源抗體表達的優(yōu)選載體［17-19］。本研究設(shè)計了一種新型AD免疫療法，在AT8的基礎(chǔ)上，設(shè)計構(gòu)建其單鏈抗體AT8-scFv，并以8型腺相關(guān)病毒為載體，對其在體內(nèi)進行長時間表達。這種新型免疫療法解決了全抗體血腦屏障透過率低、抗體半衰期短的問題。本研究構(gòu)建獲得重組腺相關(guān)病毒AAV8-AT8-scFv，并對其體內(nèi)外活性進行檢測，為AD的免疫療法提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎上皮細胞293T、載體pET20b、pAAV8、RC8、pHelper質(zhì)粒由吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院免疫藥物研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化科研團隊提供；BALB/c小鼠（遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司）；Anti-His單克隆抗體、AP標記鼠二抗、HRP標記鼠二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；p-Tau多肽由吉爾生化上海有限公司合成；Lipo293FTM轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS Lumina Ⅱ，Caliper公司）。

1.2 方法

1.2.1 AT8-scFv的表達與純化 查找PDB數(shù)據(jù)庫獲得AT8-scFv的氨基酸序列，通過基因合成方式獲得AT8-scFv的基因片段，并將其構(gòu)建到pET20b載體上。大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對AT8-scFv進行表達，鎳柱親和層析對AT8-scFv進行純化，獲得純化的單鏈抗體。

1.2.2 SDS-PAGE與Western blot 配制13.5%SDSPAGE凝膠，對樣品進行分離檢測。然后利用電泳半干轉(zhuǎn)化儀，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。牛奶溶液封閉后，Anti-His單克隆抗體孵育2 h，隨后利用AP標記鼠二抗孵育，NBT/BCIP進行顯色。

1.2.3 ELISA法檢測AT8-scFv濃度 以p-Tau包被96孔板（100 ng/孔），4 ℃過夜后洗去包被物。隨后用封閉液（含2%BSA的PBS溶液） 37 ℃封閉1 h。棄去封閉液，加入不同稀釋梯度的AT8-scFv蛋白 （1∶100～1∶1 600兩倍稀釋）或不同稀釋梯度的小鼠血清（1∶100～1∶1 600兩倍稀釋） 37 ℃孵育2 h。棄去板中液體，每孔加入Anti-His單克隆抗體，37 ℃孵育2 h。棄去板中液體，用HRP標記的鼠二抗37 ℃孵育2 h，孵育完成后，洗板并加入底物避光顯色。顯色完成后，2 mol/L硫酸終止反應，在450 nm波長處檢測OD值，OD值＞2倍背景值視為陽性結(jié)果。

1.2.4 重組腺相關(guān)病毒的包裝與純化 本研究采用三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對病毒進行包裝。首先構(gòu)建能夠表達AT8-scFv的AAV表達質(zhì)粒pAAV8-AT8-scFv以及表達紅色熒光蛋白的對照質(zhì)粒pAAV8-RFP。隨后對表達質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒pHelper及AAV8骨架質(zhì)粒RC8進行大量提取，去內(nèi)毒素后凍存?zhèn)溆谩?/p>

擴增293T細胞，待細胞密度達到70%～80%時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染（具體操作參見轉(zhuǎn)染試劑說明書）。轉(zhuǎn)染完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收取病毒。無菌條件下收取轉(zhuǎn)染后細胞，并轉(zhuǎn)入無菌離心筒。加入轉(zhuǎn)出液1/10體積的氯仿，37 ℃、220 r/min振蕩1 h。4 ℃、12 000 r/min離心 15 min后取水相，加入無菌NaCl-PEG溶液。搖勻后冰浴1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，無菌PBS重懸溶解后轉(zhuǎn)移至EP管中，加入Rnase和Dnase，隨后加入氯仿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清，獲得純化后的病毒。

1.2.5 重組腺相關(guān)病毒AAV8-AT8-scFv感染能力測定 293T細胞培養(yǎng)于6孔板，待細胞密度達到90%左右，加入100 μl滴度為1×1012vg/ml的AAV8-AT8-scFv進行感染。感染后72 h收取細胞并裂解，Western blot檢測AT8-scFv表達情況。

1.2.6 免疫方案設(shè)計 30只8周齡BALB/c雌性小鼠分為3組（陰性對照生理鹽水組、病毒對照AAV8-RFP組、實驗組AAV8-AT8-scFv），10只/組。在第0周進行左大腿肌肉注射免疫，劑量為：生理鹽水100 μl，AAV8-RFP和AAV8-AT8-scFv注射100 μl滴度為1×1012vg/ml的病毒。每周對小鼠進行采血，檢測血清中AT8-scFv含量。

1.2.7 小動物活體成像 在第0、2、4、8周分別處死1只生理鹽水組與AAV8-RFP組小鼠，分離腿部組織，并去掉皮毛，進行活體成像觀察。實驗條件為：激發(fā)波波長587 nm，發(fā)射波波長610 nm。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，組間比較采用t-檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AT8-scFv的表達與純化 本研究成功獲得AT8-scFv蛋白。其SDS-PAGE和Anti-His Western blot結(jié)果圖1所示。蛋白大小約為25 kD，純度達到95%以上。

圖1 AT8-scFv的表達與純化Fig.1 Expression and purification of AT8-scFv

2.2 AT8-scFv在體外與p-Tau具有較好的結(jié)合活性 ELISA檢測AT8-scFv與p-Tau的結(jié)合活性，結(jié)果如圖2所示。AT8-scFv能夠與p-Tau相結(jié)合，其結(jié)果在1∶400的稀釋梯度下依舊呈陽性。提示AT8-scFv較好地保留了其全抗體的結(jié)合能力，在AD的治療方面具有研究價值。

圖2 ELISA法檢測AT8-scFv與p-Tau的結(jié)合活性Fig.2 ELISA assay to determine binding activity of AT8-scFv to p-Tau

2.3 重組腺相關(guān)病毒的包裝與純化 本研究成功構(gòu)建了AT8-scFv的表達質(zhì)粒pAAV8-AT8-scFv及紅色熒光蛋白的表達質(zhì)粒pAAV8-RFP，并利用293T細胞和三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對AAV8-AT8-scFv、AAV8-RFP進行包裝與純化。SDS-PAGE檢測病毒的包裝情況，結(jié)果如圖3所示。AAV8-AT8-scFv與AAV8-RFP包裝成功，其中3個衣殼蛋白VP1、VP2、VP3的含量比例約為1∶1∶10。RT-qPCR檢測病毒滴度，AAV8-AT8-scFv的滴度為3.9×1012vg/ml，AAV8-RFP的滴度為2.8×1012vg/ml。

圖3 AAV8-AT8-scFv衣殼蛋白的SDS-PAGE電泳檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of capsid proteins of AAV8-AT8-scFv

2.4 重組腺相關(guān)病毒具有較好的感染與表達能力 利用293T細胞檢測重組病毒感染能力與表達能力，結(jié)果如圖4所示。圖4A為AAV8-RFP的感染熒光觀察結(jié)果，隨著感染時間延長，紅色熒光逐漸加強，并在72 h時達到高峰。圖4B為AAV8-AT8-scFv感染后表達能力檢測結(jié)果，Western blot結(jié)果顯示AAV8-AT8-scFv能夠很好地表達AT8-scFv，且表達量較高。

圖4 rAAV感染及表達能力檢測Fig.4 Detection of infection and expression ability of rAAV

2.5 重組腺相關(guān)病毒AAV8-AT8-scFv能夠在小鼠體內(nèi)長時間表達單鏈抗體 小動物活體成像觀察重組腺相關(guān)病毒AAV8-RFP在小鼠體內(nèi)的感染與表達情況，結(jié)果如圖5所示。病毒注射2周后開始在體內(nèi)表達，8周時表達范圍幾乎覆蓋全腿。ELISA法檢測AAV8-AT8-scFv免疫組小鼠血清中AT8-scFv含量，用已知濃度的AT8-scFv為標準品制作標準曲線，進行濃度計算。實驗結(jié)果如圖6所示，在免疫后2周左右，AT8-scFv開始在血液中出現(xiàn)，隨著時間延長，抗體濃度逐漸增加?？贵w濃度在第8周達到高峰，隨后抗體濃度穩(wěn)定在20 μg/ml左右。提示AAV8-AT8-scFv在體內(nèi)具有非常好的表達能力，能夠?qū)捂溈贵w進行長時間表達，表達時間至少能夠持續(xù)3個月。

圖5 小動物活體成像檢測rAAV在小鼠體內(nèi)表達情況Fig.5 Expression ability of rAAV in mice using vivisection imaging system

圖6 ELISA檢測AT8-scFv在小鼠血清中的濃度Fig.6 Serum concentration of AT8-scFv was detected by ELISA

3 討論

AD是一種復雜的多因素疾病，目前尚無有效手段延緩其疾病進程［13］。繼淀粉級聯(lián)假說后，p-Tau蛋白作為AD的主要致病物質(zhì)之一，逐漸成為研究焦點，靶向Tau蛋白的免疫療法更是前景廣闊［20］。2017年WEST等［21］開發(fā)了一種人源化Tau抗體 （ABBV-8E12），該抗體于2021年完成了針對輕度AD患者的Ⅱ期臨床試驗，試驗結(jié)果顯示ABBV-8E12具有良好的安全性和有效性［22］。此外，BIIB092是人源化的IgG4單克隆Tau抗體，QURESHI等［23］對BIIB092進行了臨床研究，該抗體表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性，且對p-Tau的抑制程度呈劑量依賴性。雖然靶向Tau蛋白的被動免疫療法已經(jīng)取得了很大進展，但傳統(tǒng)的全抗體治療方式依舊存在很多弊端。如全抗體分子量大、血腦屏障透過率低、安全性差、半衰期短等，都限制了其應用［24］。如何設(shè)計開發(fā)一種安全有效的AD免疫療法成為研究者目前迫切的需求。

本研究設(shè)計了一種新型靶向p-Tau的AD免疫療法。在治療型抗體AT8的基礎(chǔ)上，對其進行改造，獲得其單鏈抗體AT8-scFv，并利用AAV8對其在體內(nèi)進行長時間表達。本研究成功獲得了能夠表達AT8-scFv的重組腺相關(guān)病毒AAV8-AT8-scFv，并對其理化性質(zhì)進行了表征。體外實驗結(jié)果顯示，其具有較好的感染能力，所表達的抗體AT8-scFv具有較強的結(jié)合活性。本研究以小鼠為動物模型，探究其體內(nèi)表達情況。結(jié)果顯示，該重組腺相關(guān)病毒能夠在體內(nèi)對AT8-scFv進行長時間表達。在下一步的實驗中，課題組將繼續(xù)對重組病毒進行優(yōu)化，提高其表達量，延長其表達時間。隨后利用AAV8-AT8-scFv對不同年齡段的AD模型鼠進行治療，進一步探究該免疫療法對AD模型小鼠的神經(jīng)保護作用，為AD的新型免疫療法奠定基礎(chǔ)。