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    HLA新等位基因B*46:30序列分析及其編碼MHC蛋白分子結(jié)構(gòu)預(yù)測 與表型鑒定①

    2023-03-04 04:33:18聶向民朱傳福朱海峰喬文本邵靜茹
    中國免疫學(xué)雜志 2023年1期
    關(guān)鍵詞:差異分析

    聶向民 朱傳福 朱海峰 張 毅 喬文本 劉 艷 邵靜茹

    (山東省血液中心中華骨髓庫山東省分型實(shí)驗(yàn)室/HLA研究室,濟(jì)南 250014)

    人 類 白 細(xì) 胞 抗 原(human leukocyte antigen, HLA)是人類最復(fù)雜、最具多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng),在自我識別和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。HLA等位基因的發(fā)現(xiàn)鑒定對于闡明人類免疫系統(tǒng)的基因多樣性十分重要。截至2021年9月,已發(fā)現(xiàn)報道HLA等位基因30 862個[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)與測序分型技術(shù)的發(fā)展,越來越多的HLA新等位基因被發(fā)現(xiàn)報道。一般僅對HLA新等位基因序列進(jìn)行一般性描述,未對其編碼氨基酸差異在MHC分子結(jié)構(gòu)中的可能影響進(jìn)行分析,對其血清學(xué)表型一般也較少檢測鑒定。本實(shí)驗(yàn)室在對山東地區(qū)中華骨髓庫造血干細(xì)胞供者進(jìn)行HLA高分辨分型時,發(fā)現(xiàn)1例HLA-B位點(diǎn)新等位基因,被世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會命名為B*46:30。通過SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB軟件,對其氨基酸變異在MHC編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的可能影響進(jìn)行模擬分析,應(yīng)用Histocheck、FATCAT軟件在線對比分析其蛋白分子間差異,并對其血清型表型進(jìn)行檢測鑒定,現(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 資料 樣本來自中華骨髓庫,造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者為山東淄博地區(qū)的漢族男性。

    1.2 方法

    1.2.1 Luminex液相流式PCR-SSOP分型 HLAA、B、DRB1高分辨分型采用Luminex平臺液相流式PCR-SSOP雜交分型,使用美國One Lambda LABType?HD分型試劑。首先進(jìn)行HLA位點(diǎn)PCR擴(kuò)增,然后對DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性、中和,磁珠探針雜交,洗滌,SAPE(Streptavidin phycoerythrin)熒光標(biāo)記,洗滌,上機(jī)檢測讀取數(shù)據(jù)。

    1.2.2 PCR-SBT分型 PCR-SBT(Sequence based typing)復(fù)核使用ROSE Europe HLA SBT分型試劑。進(jìn)行HLA位點(diǎn)PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)ExoI/SAP酶純化后,對HLA-A/B位點(diǎn)2、3、4外顯子進(jìn)行正反雙向測序PCR,測序產(chǎn)物經(jīng)乙醇/醋酸鈉沉淀,熱變性速冷后ABI 3730毛細(xì)管測序電泳。Conexio分析軟件判讀分型結(jié)果。

    1.2.3 單等位基因特異性測序 使用HLAssure SE SBT(Texas BioGene Inc., Texas, USA.)單等位基因組特異性測序分型試劑,首先對樣本HLA-B*46、B*57進(jìn)行等位基因組特異性擴(kuò)增,以分開該位點(diǎn)的雜合等位基因。擴(kuò)增產(chǎn)物ExoI/SAP酶純化后,以陽性組PCR產(chǎn)物為模板,進(jìn)行2、3、4外顯子正反雙向測序PCR,1、5外顯子正向測序PCR。測序PCR產(chǎn)物再經(jīng)回收純化、熱變性速冷, ABI 3730測序儀測序電泳分析。AceuType SBT分型軟件數(shù)據(jù)分析。

    1.2.4 MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)預(yù)測與差異分析

    1.2.4.1 模擬分析差異氨基酸殘基在MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置、理化性質(zhì)等變化 將新等位基因B*46:30及提交SWISS-MODEL同源建模在線服務(wù)器,結(jié)果數(shù)據(jù)文件通過RCSB PDB軟件,獲得MHC分子三維結(jié)構(gòu)模擬圖像。HLA-B46蛋白分子結(jié)構(gòu)由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得。模擬分析差異氨基酸殘基在MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置、理化性質(zhì)等變化差異。

    1.2.4.2 DSS值比較 HISTOCHECK在線比較B*46:01與B*46:30間差異,并將B*46:01與B*46:30及B*46常見及確認(rèn)等位基因(common alleles and well documented alleles,CDW):B*46:08、B*46:09、B*46:12、B*46:18、B*46:19間DSS值(dissimilarity score),以及A*02:01與A*02:03間DSS值進(jìn)行比較[2-3]。

    1.2.4.3 RMSD值比較 FATCAT在線比較B*46:30與B*46:01間均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD),并將B*46:01與B*46:30及B*46 CDW常見及確認(rèn)等位基因間RMSD值,以及A*02:01與A*02:03間RMSD值進(jìn)行比較[4]。

    1.2.5 血清學(xué)表型檢測鑒定 血清學(xué)表型檢測使用Terasaki HLA Class I Asian Dry Typing Tray,Lot#2 Cat. ASN72D分型板進(jìn)行微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)。重新采集捐獻(xiàn)者新鮮ACD抗凝靜脈血,One Lambda熒光磁珠法分離T淋巴細(xì)胞,RPMI1640培養(yǎng)液混懸調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2 000個/μl,分型板每孔中加入淋巴細(xì)胞1 μl,OLI補(bǔ)體1 μl,37 ℃孵育1 h,加入熒光終止劑5 μl。Olympus熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果。NIH法分?jǐn)?shù)判定:1%~10%死細(xì)胞為1分(陰性);11%~20%死細(xì)胞為2分(陰性可疑);21%~40%死細(xì)胞為4分(弱陽性反應(yīng));41%~80%死細(xì)胞為6分(陽性反應(yīng));81%~100%死細(xì)胞為8分(強(qiáng)陽性反應(yīng))。

    2 結(jié)果

    2.1 Luminex PCR-SSOP分型 HLA Luminex流式SSOP雜交分型顯示B位點(diǎn)結(jié)果異常,無法給出完全匹配的分型結(jié)果。

    2.2 PCR-SBT分型 HLA-B位點(diǎn)SBT雙鏈混合測序復(fù)核,顯示該位點(diǎn)無法給出完全匹配的分型結(jié)果。結(jié)果顯示該位點(diǎn)同源性最高的等位基因組合為B*46:01:01、57:01:01,但存在2個堿基差異,即第3外顯子第559位核苷酸序列為S(C/G)而非C,第560位為W(A/T)而非T(圖1),存在2個堿基差異替代。

    圖1 PCR-SBT結(jié)果Fig.1 PCR-SBT results

    2.3 單等位基因組特異性測序 單等位基因組特異性測序表明初次SBT結(jié)果所顯示堿基改變發(fā)生在B*46:01:01序列,即第3外顯子第559、560位核苷酸發(fā)生C->G、T->A替代改變(圖2),其相應(yīng)第163位密碼子由CTG>GAG,其編碼氨基酸由亮氨酸(Leu,L)變?yōu)楣劝彼幔℅lu,E)。

    圖2 單等位基因SBT測序結(jié)果Fig.2 Single allele specific SBT results

    2.4 申報命名 將序列遞交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫,注冊序列號JN209964,經(jīng)EMBL-EBI申報被世界衛(wèi)生組織WHO HLA因子命名委員會正式命名為B*46:30。其HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)最終分型結(jié)果為A*02:07,24:02;B*46:30,57:01:01;DRB1*07:01, 08:03。

    2.5 新等位基因編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)模擬分析

    2.5.1 蛋白分子三維結(jié)構(gòu) 使用SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB軟件,獲得B*46:30編碼蛋白分子三維空間結(jié)構(gòu)模擬圖像見圖3。HLA-B46蛋白分子結(jié)構(gòu)(X-ray Diffraction 1.6 ?)由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得。

    圖3 B*46:01與B*46:30編碼MHC蛋白分子三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Comparisons of predicted MHC molecular structures between B*46:01 and B*46:30 molecules

    模擬分析顯示,B*46:30第163位差異氨基酸殘基位于α2結(jié)構(gòu)域構(gòu)成抗原結(jié)合凹槽groove側(cè)壁的α螺旋上。相較于B*46:01,HLA-B*46:30第163位氨基酸殘基由疏水性脂肪族亮氨酸(L)→B*46:30帶負(fù)電荷的酸性谷氨酸(E)。RCSB PDB模擬分析還顯示,B*46:30的該谷氨酸殘基(163E)側(cè)鏈上的羧基COOH可跨越groove凹槽與α1結(jié)構(gòu)域α螺旋上第62位堿性精氨酸(62R)側(cè)鏈上的C=NH之間形成氫鍵。

    2.5.2 Histocheck在線比較B*46:01與B*46:30差異 R值(Risler's score)及DSS(Dissimilarity score)值,見表1。B*46:01與B*46:30、B*46CDW(常見及確認(rèn)等位基因)間DSS值[3],以及A*02:01與A*02:03 間DSS值比較,見表2。

    表1 B*46:01與B*46:30 間結(jié)構(gòu)比較DSS值及R值Tab.1 DSS Score and R Score compared between B*46:01 and B*46:30

    表2 B*46:01與B*46:30、B*46 CWD間, A*02:01與A*02:03間DSS值Tab.2 DSS of structure comparisons between B*46:01 and B*46:30/B*46CWD,A*02:01 and A*02:03

    2.5.3 FATCAT在線比較B*46:01與B*46:30、B*46 CDW間差異,以及A*02:01與A*02:03間差異 RMSD(root-mean-square deviation)值(?)比 較見表3。

    表3 B*46:01與B*46:30、B*46 CWD間,A*02:01與A*02:03間結(jié)構(gòu)比較RMSD值(?)Tab.3 RMSD(?) of structure comparisons between B*46:01 and B*46:30/B*46CWD, A*02:01 and A*02:03

    2.6 血清學(xué)表型檢測鑒定 HLA-B位點(diǎn)血清學(xué)表型檢測鑒定反應(yīng)格局,見表4。其中12D、12E、6E、12A孔反應(yīng)結(jié)果見圖4、圖5。血清學(xué)檢測結(jié)果顯示B46特異性(12D、12E孔)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。

    圖4 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定12D、12E孔反應(yīng)結(jié)果Fig.4 Reactions of 12D, 12E of Terasaki HLA class Ⅰasian typing tray

    圖5 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定6E、12A孔反應(yīng)結(jié)果Fig.5 Reactions of 6E,12A of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

    表4 Terasaki HLA Ⅰ類分型板表型鑒定反應(yīng)格局表Tab.4 Reaction results( Worksheet) of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

    3 討論

    HLA編碼基因位于人類第6號染色體短臂6P21.31~21.33,由一組緊密連鎖的復(fù)等位基因位點(diǎn)組成,是人類基因組中已知基因最密集的區(qū)域。其基因結(jié)構(gòu)以高度多態(tài)性為主要特征,每個位點(diǎn)含有大量的復(fù)等位基因,且其分布具有明顯的種族、地區(qū)差異。HLA的這種高度多態(tài)性顯示了遺傳背景的多態(tài)性和復(fù)雜性,被認(rèn)為是人類在進(jìn)化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應(yīng)性表現(xiàn),使人類具有更大的抵抗病原體入侵的能力,對維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學(xué)意義。

    B*46等位基因在亞洲人群中頻率較高,明顯高于高加索白人和黑人。B*46:01在亞洲、高加索白人、黑人人群中基因頻率分別為7.46%、0.06%、0.05%[5]。B*46:01在 中 國 人 群 中 基 因 頻 率 為10.42%[3]。如按4位高分等位基因計(jì)算,B*46:01頻率高于B*40:01(9.787%)而在B位點(diǎn)中位列首位[3]。在本實(shí)驗(yàn)室所作低分辨分型基因頻率統(tǒng)計(jì)中,B*46在山東地區(qū)(中國北方)人群中頻率(0.0558),位列B*13(0.1431)、B*15(62)(0.0727)、B*51(0.0702)、B*15(60)(0.0605)之后[6]。

    為了對B*46:30差異氨基酸殘基在MHC分子三維結(jié)構(gòu)中的空間位置及其可能的生物學(xué)影響進(jìn)行模擬分析,使用SWISS-MODEL在線服務(wù)器及RCSB PDB軟件,對其MHC編碼蛋白分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析,以期對其編碼氨基酸殘基改變對MHC分子抗原多肽結(jié)合及TCR/抗體結(jié)合功能的可能影響進(jìn)行初步預(yù)測分析。

    既往研究顯示,構(gòu)成抗原多肽結(jié)合凹槽的氨基酸殘基,對其抗原多肽結(jié)合特性至關(guān)重要,以上關(guān)鍵位置單個氨基酸殘基理化性質(zhì)的改變,包括殘基側(cè)鏈的大小、伸展方向、疏水性等理化性質(zhì)的改變,都可對結(jié)合凹槽與抗原多肽的結(jié)合產(chǎn)生影響,并可直接或通過與多肽結(jié)合特異性的改變,影響HLA等位基因與T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)及抗體的結(jié)合。此外,α螺旋上表面朝向上外側(cè)殘基側(cè)鏈理化性質(zhì)的改變,以及引起的可與TCR/抗體結(jié)合區(qū)域表面結(jié)構(gòu)形狀的改變,都可引起與TCR和/或抗體結(jié)合功能的改變[7-8]。同時這些區(qū)域也是序列多態(tài)性集中的區(qū)域。

    通過模擬分析可得,B*46:30的第163位差異氨基酸殘基位于抗原結(jié)合凹槽側(cè)壁的α螺旋上的關(guān)鍵位置。相較HLA-B*46:01,B*46:30第163位氨基酸殘基由疏水性脂肪族亮氨酸L變?yōu)閹ж?fù)電荷的酸性谷氨酸E。PDB模擬分析還顯示,發(fā)生改變以后,該163位帶負(fù)電荷的酸性谷氨酸(163E)側(cè)鏈上的羧基COOH可跨越groove凹槽與α1結(jié)構(gòu)域α螺旋上的第62位堿性精氨酸(62R)側(cè)鏈上的C=NH之間形成氫鍵。HistoCheck分析示其R值=32,并顯示163位為9肽P1、P2、P3位、HLA I類多肽以及TCR的結(jié)合位點(diǎn)[9]。以往研究顯示該位置是參與構(gòu)成抗原多肽結(jié)合凹袋Pocket A的關(guān)鍵位置[10]。同時,該位置亦是B*46:01構(gòu)成163LW eplet的關(guān)鍵位置,也是許多HLA-I類等位基因構(gòu)成163 eplet的關(guān)鍵位置[11]。根據(jù)結(jié)果推測,以上改變將有可能對其groove結(jié)合凹槽的多肽結(jié)合特性,以及α螺旋與TCR和/或抗體的結(jié)合特性產(chǎn)生影響,引起其結(jié)合特性的改變。

    R值是由RISLER等[12]提出的通過氨基酸距離矩陣計(jì)算單對氨基酸交換之間的差異。其基本概念是,如果兩種氨基酸越相似,則它們在功能相關(guān)蛋白中相互替換的頻率越高。因此具有低取代率的氨基酸對(代表功能差異)產(chǎn)生更高的分值。DSS值是將HLA分子的多態(tài)性殘基分為主要(肽結(jié)合凹槽和/或TCR接觸區(qū)域)和次要(剩余氨基酸殘基)潛在同種異體反應(yīng)性區(qū)域,通過將不同區(qū)域中每對氨基酸差異的R值加權(quán)相加而得出DSS值,作為一種同種反應(yīng)性指標(biāo)[13]。

    通過將B*46:30及B*46常見及確認(rèn)等位基因與B*46:01間的DSS值比較可以看出,B*46:30與B*46:01的DSS值1.32處于較低水平,明顯低于A*02:01與A*02:03間的3.98。A*02:03與A*02:01是臨床低分辨分型需要分開的不同血清型的等位基因,具有較高的同種反應(yīng)差異性。這可能與B*46:30與B*46:01間僅存在單個氨基酸差異有關(guān)。但通過FATCAT在線分析,獲得B*46:01與B*46:30間RMSD值為0.59 ?,可以看到B*46:01與B*46:30間RMSD值較高,甚至高于A*02:01與A*02:03間的0.44 ?,與DSS值之間并無較一致的對應(yīng)關(guān)系。這也反映了現(xiàn)有眾多自動蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對比算法常產(chǎn)生難以解釋的矛盾結(jié)果,且難以確定界值的現(xiàn)實(shí)狀況[14-15]。有國內(nèi)研究將修正RMSD值定為0.50?,作為allo-HSCT異基因造血干細(xì)胞移植發(fā)生Ⅰ/Ⅱ級aGVHD與Ⅲ/Ⅳ級aGVHD間的分界值[16]。

    B*46:30血清學(xué)表型檢測顯示其B46特異性呈強(qiáng)陽性反應(yīng),即其表型鑒定為B46,顯示該血清學(xué)抗原分型板中所含單克隆抗體微量淋巴毒反應(yīng)未能對B*46:30的163LW→EW eplet改變產(chǎn)生可見差異反應(yīng)。另外,本次檢測6E孔(B7+/-55)顯示存在部分死細(xì)胞的弱陽性反應(yīng),分析懷疑該交叉反應(yīng)是否可能由B7的163EW的eplet引起,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,12A孔BW6反應(yīng)陰性,考慮可能為抗體血清學(xué)反應(yīng)質(zhì)量問題。

    雖然B*46:30血清學(xué)表型鑒定為B46未見明顯改變,但通過以上分析,本課題組推測其差異氨基酸殘基的改變,在可能導(dǎo)致B*46:30多肽結(jié)合功能的改變的同時,仍有可能直接及/或通過多肽結(jié)合功能的改變,影響其與TCR及抗體的結(jié)合特性,并可能對臨床造血干細(xì)胞移植及排異反應(yīng)產(chǎn)生影響。上述推測尚需今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

    在國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)HLA新等位基因的報道中,一般僅對其變異序列進(jìn)行一般性描述報告,未對其結(jié)構(gòu)差異及生物學(xué)影響進(jìn)行探討分析。本文通過對B*46:30編碼蛋白分子三維結(jié)構(gòu)模擬分析,對其差異氨基酸變異的可能影響進(jìn)行初步探討分析,對今后新等位基因功能研究具有一定的借鑒意義。

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