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    血清外泌體中miR-642a-3p下調(diào)HK1對(duì)胰島素分泌和兒童1型糖尿病進(jìn)展的影響

    2023-03-04 04:33:18邊青霞牛春華任志剛勝利油田中心醫(yī)院內(nèi)分泌科東營(yíng)257034
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2023年1期
    關(guān)鍵詞:外泌體高糖熒光素酶

    邊青霞 牛春華 任志剛 (勝利油田中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,東營(yíng) 257034)

    糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)是一種伴有多種 并發(fā)癥的慢性內(nèi)分泌疾病,是僅次于癌癥和心臟病的現(xiàn)代疾病中的第三殺手,在兒童中主要為經(jīng)典1型糖尿病(classic type 1 diabetes mellitus,T1DM)[1-2]。其發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一是自身免疫介導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞受到破壞,繼而導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素缺乏,T1DM的高血糖可危及生命[3-4]。因此,有必要對(duì)T1DM的具體發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。

    microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為21~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA,其可通過(guò)與靶基因的mRNA特異性結(jié)合,在翻譯后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而作用于細(xì)胞增殖、凋亡、分化和維持免疫系統(tǒng)細(xì)胞庫(kù)等[5-6]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNAs在自身免疫性疾病和T1DM中異常表達(dá),可作為T1DM診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物,調(diào)控高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞死亡等細(xì)胞功能障礙并參與T1DM的發(fā)病過(guò)程[7-10]。既往研究證實(shí)血清外泌體miR-642a-3p在糖尿病腎病患兒中的表達(dá)顯著高于健康志愿者,可能是診斷和治療糖尿病腎病的候選分子[11]。但miR-642a-3p在兒童T1DM中可能發(fā)揮的功能尚未有相關(guān)報(bào)道。miRNAs在T1DM中的作用和調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,本研究試圖尋找調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵miRNA分子及其靶向的下游mRNA,探究其對(duì)兒童T1DM的影響,這對(duì)該病的防治具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料 胰島素分泌細(xì)胞株MIN6購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種保藏中心;10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TaqMan miRNA RT kit試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;PrimeScript RT試劑盒購(gòu)自日本Ta-KaRa公司;Trizol試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司;抗體均由上海煊翎生物科技有限公司提供;紫外-可見光分光光度計(jì)(UV-1500)購(gòu)自上海美析儀器有限公司;外泌體鑒定試劑盒購(gòu)自翊圣生物;生物性透射電鏡購(gòu)自日本Hitachi公司;雙熒光素酶質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司;雙熒光素酶檢測(cè)儀器購(gòu)自德國(guó)Berthold公司;血清血漿miRNA提取試劑盒購(gòu)自新海基因有限公司;外泌體轉(zhuǎn)染Exo-FectExosome Transfection Kit購(gòu)自美國(guó)SBI公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物;血清外泌體分離試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因有限公司;高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)、胰島素(insulin,Ins)ELISA試劑盒購(gòu)自北京諾為生物。

    1.2 方法

    1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GEO芯片表達(dá)數(shù)據(jù),選擇T1DM芯片GSE94649,使用limma包分析差異表達(dá)的miRNAs,差異篩選條件為adj.Pvalue<0.05和|Log Fold Change|>1。在TargetScan(http://www.targetscan.org/mamm_31/)網(wǎng) 站獲取miRNAs的下游靶基因。DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/search)中查詢T1DM的風(fēng)險(xiǎn)基因。String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)用于分析蛋白互作用關(guān)系。

    1.2.2 血清樣本收集 將2018年1月至2020年 1月于勝利油田中心醫(yī)院兒科診室內(nèi)分泌疾病代謝科就診、符合《中國(guó)1型糖尿病診治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)的T1DM患兒納入本試驗(yàn)。收集納入對(duì)象的一般資料(年齡、性別)和血糖資料(自我指尖血糖檢測(cè) 值,單位mmol/L)。68例T1DM患兒中男36例,女32例,年齡3.5~17.2歲,平均(8.6±4.2)歲。選擇同期于勝利油田中心醫(yī)院體檢的健康兒童68例為對(duì)照組。兩組均行早晨空腹血樣采集,每位患者采血 10 ml。血清管于室溫下靜置30 min,隨后轉(zhuǎn)移至4 ℃條件下靜置4 h。移液器吸取淡黃色血清后轉(zhuǎn)移至離心管,3 000 g離心10 min。再次取上清轉(zhuǎn)移至離心管。-80 ℃凍存用于后續(xù)外泌體的提取。在試驗(yàn)進(jìn)行前研究對(duì)象及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書,本研究已獲得勝利油田中心醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2.3 血清外泌體分離 將收集到的血清樣品與試劑盒中外泌體純化試劑以5∶1體積比充分混合,混勻后4 ℃孵育12 h。隨后1 500 g離心20 min收集外泌體沉淀后棄去上清液。再次離心5 min,吸除殘液,沉淀即為所需外泌體。隨后采用PBS重懸沉淀用進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    1.2.4 外泌體形態(tài)鑒定 采用120 kV生物透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察樣本中外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小,首先將樣本滴加至銅網(wǎng),1 min后濾紙吸干表面浮液,滴加1%醋酸氧鈾反應(yīng)15 s后再次用濾紙吸去表面浮液。白熾燈下烤干后于TEM下觀察并拍照,外泌體通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形,略小于100 nm且具有清晰的雙層囊膜結(jié)構(gòu)。

    1.2.5 外泌體標(biāo)志蛋白檢測(cè) 在樣本中加入同體積的預(yù)冷裂解液冰上裂解15 min。轉(zhuǎn)移到4 ℃條件下12 000 g離心5 min后吸取上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。隨后將樣本和試劑盒中的CD63&TSG101陽(yáng)性對(duì)照品同時(shí)經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜后于5%脫脂奶粉中常溫封閉1.5 h。加入一抗Anti-CD63抗體(1∶1 000~1∶2 000稀釋)、Anti-TSG101抗體(1∶500~1∶1 000稀釋),4 ℃下孵育過(guò)夜。次日漂洗后加入山羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000~1∶10 000稀釋),室溫下孵育50 min后繼續(xù)漂洗。在最后1次漂洗的同時(shí)配制ECL發(fā)光工作液。將膜與ECL工作液充分接觸,室溫孵育3 min后瀝去工作液,壓片曝光5 s,顯影沖洗。采用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值。

    1.2.6 外泌體轉(zhuǎn)染 采用Exo-FectExosome Transfection Kit試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Exo-Fect可將核酸直接轉(zhuǎn)移至分離的外泌體中。將miR-642a-3p mimic、mimic-NC、miR-642a-3p inhibitor、inhibitor-NC分別與Exo-Fect試劑和分離得到的血清外泌體混勻,形成運(yùn)載體,即可進(jìn)行外泌體與靶細(xì)胞的共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染序列:miR-642a-3p inhibitor:5'-UACCGAGCAUUAUAUCCCAUCCACUAC-3',inhibitor-NC:5'-AUCCGAUAACCCGAGACUUCCCAUCAC-3',miR-642a-3p mimic:5'-UACCGAGCAUUAUAUCCCAUCCACUGC-3',mimic-NC:5'-UACCCAAUGACCUACCUCUAGCUAUCU-3'。

    1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 胰島素分泌細(xì)胞株MIN6培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 g/L鏈霉素和慶大霉素),37 ℃、5%CO2下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基,PBS清洗,0.25%胰蛋白酶消化后傳代。配制含3.7 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液。各組細(xì)胞吸棄原有培養(yǎng)基后,先用3.7 mmol/L的葡萄糖KRB緩沖液清洗后再加入500 μl進(jìn)行孵育,設(shè)為未高糖培養(yǎng)組。2 h后吸棄,再次清洗并孵育0.5 h;或吸棄剩余緩沖液后加入25 mmol/L的葡萄糖KRB緩沖液孵育1 h,設(shè)為高糖培養(yǎng)組。將高糖培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前1 d更換為不含胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基,分別將pcDNA3.1、pcHK1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后更換RPMI1640完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

    1.2.8 外泌體的攝取 采用外泌體綠色熒光標(biāo)記染料PKH67檢測(cè)高糖培養(yǎng)胰島β細(xì)胞對(duì)外泌體的吞噬作用。確定外泌體的蛋白量后,在避光條件下用試劑盒中的B液(Diluent C)稀釋A液(PKH67 linker)配制染料工作液。隨后加入外泌體中,渦旋振蕩2 min,靜置孵育15 min,復(fù)合物中加入10 ml的1×PBS混勻。提取外泌體去除染料,重懸沉淀物,即為染色后的外泌體。將胰島β細(xì)胞與熒光標(biāo)記的外泌體共培養(yǎng)24 h,常規(guī)多聚甲醛溶液固定后加入DAPI染料進(jìn)行核復(fù)染,熒光顯微鏡下觀察染色情況。

    1.2.9 雙熒光素酶分析報(bào)告試驗(yàn) 根據(jù)生物預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的miRNA靶基因結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增靶基因3'UTR,插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MIN6細(xì)胞,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別將構(gòu)建的野生型(wild type,WT)-HK1、突變型(mutant type,MUT)-HK1與miR-NC、miR-642a-3p mimic用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至MIN6細(xì)胞,48 h后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè),螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因熒光素酶活性。

    1.2.10 流式細(xì)胞術(shù) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,2 000 g離心5 min后收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌2~3次,每次洗滌后均需再次離心。收集細(xì)胞后吸棄PBS,加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC染色液在2~8 ℃下避光孵育20 min,隨后加入10 μl PI染色液,混勻后再次避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。

    1.2.11 CCK-8 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高糖培養(yǎng)的胰島 β細(xì)胞用0.25%胰酶消化,并接種于96孔板,在37 ℃、5%CO2條件下預(yù)培養(yǎng)。每孔加入10 μl CCK-8溶液,孔中保證無(wú)氣泡,隨后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2~3 h。酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm 處的吸光度(optical density,OD)值。細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/對(duì)照組平均OD值×100%。1.2.12 GLP-1定量檢測(cè) 高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞上清液中GLP-1濃度采用雙抗體兩步夾心ELISA試劑盒測(cè)定。試驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作,在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值,以O(shè)D值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制相應(yīng)曲線,根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出待測(cè)樣品中GLP-1的相應(yīng)濃度。

    1.2.13 Ins分泌定量檢測(cè) 高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞上清液中Ins濃度的檢測(cè)采用雙抗體兩步夾心ELISA試劑盒進(jìn)行。收集各組細(xì)胞上清液,上清液可在-80 ℃條件下冷藏放置,隨后3 000 g離心10~15 min,按照ELISA試劑盒測(cè)定Ins含量。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。

    1.2.14 qRT-PCR EP管中加入800 μl血清/血漿miRNA試劑與血清樣本混勻后于室溫條件下放置5 min,15 000 g離心5 min后將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管,加入1 ml異丙醇并混合均勻。分3次加至吸附柱中并以15 000 g離心15 s,棄過(guò)柱液。加入75%異丙醇洗滌后再次離心15 s,棄過(guò)濾液。重復(fù)1次操作。吸附柱加入RnaseFree H2O,2 min后15 000 g離心2 min,洗脫產(chǎn)物即為提取的RNA。外泌體、細(xì)胞中RNA提取采用TRIzol法:吸棄培養(yǎng)液后加入PBS清洗。加入1 ml TRIzol裂解后吹打,裂解液轉(zhuǎn)移至EP管,室溫靜置5 min,加入0.2 ml氯仿,振蕩15 s至分層,12 000 g離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移,加入同體積異丙醇。-20 ℃下靜置5 min,15 000 g離心10 min,吸棄上清。保留沉淀加入預(yù)冷的75%乙醇,混勻靜置,再次離心。加入RnaseFree H2O溶解總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度。隨后采用TaqMan miRNA RT kit 對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,該試劑盒通過(guò)3個(gè)poly-A拖尾法完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),借助試劑盒通用逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo(dT)12-18擴(kuò)增cDNA,HK1使用PrimeScript RT試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),具體操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),以cDNA為模板,特異性引物為正向引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),miR-642a-3p以U6為內(nèi)參,其余以GAPDH為內(nèi)參。利用Real-Time PCR儀進(jìn)行相應(yīng)的PCR反應(yīng),計(jì)算采用2-ΔCt法,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參。引物設(shè)計(jì)由上海吉瑪基因公司完成,見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR sequences

    1.2.15 Western blot試驗(yàn)檢測(cè)HK1蛋白表達(dá) 采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。加入Anti-HK1一抗(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜。次日漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋),室溫下孵育50 min后繼續(xù)漂洗。其余試驗(yàn)操作同1.2.5。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS24.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)用±s表示,組內(nèi)兩兩比較使采用post-hoc檢驗(yàn),組間差異采用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)表示,多組間比較采用單因素方差分析。受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線判斷診斷效率,比較曲線下面積(area under the curve,AUC)大小。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 經(jīng)預(yù)測(cè)miR-642a-3p在T1DM中高表達(dá) GSE94649芯片信息主要分析了T1DM患者血清中的差異表達(dá)miRNAs,該芯片中包含6例T1DM患者及6例健康人群的血清miRNAs信息?;鹕綀D顯示,相對(duì)于健康人群,T1DM中差異表達(dá)的miRNAs有 4個(gè),其中1個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào)(圖1A)。加載熱圖并結(jié)合以往文獻(xiàn),最終選擇在T1DM患者血清中顯著高表達(dá)的miR-642a-3p作為本文研究對(duì)象(圖1B)。

    圖1 miR-642a-3p在T1DM中差異表達(dá)Fig.1 miR-642a-3p was differentially expressed in T1DM

    2.2 血清外泌體鑒定 經(jīng)TEM觀察可見外泌體大小在60 nm左右且包膜完整,具有清晰雙層膜結(jié)構(gòu),為大小均一、單個(gè)分布或聚集成群的茶杯狀囊泡(圖2A);Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示TSG101與CD63均呈陽(yáng)性(見圖2B,P<0.05),經(jīng)鑒定本研究成功分離血清外泌體。

    圖2 血清外泌體鑒定Fig.2 Identification of serum exosomes

    2.3 miR-642a-3p在T1DM患兒血清外泌體中表達(dá)顯著升高且與血糖濃度相關(guān) qRT-PCR定量分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-642a-3p在T1DM患者血清及血清外泌體中均呈高表達(dá)(圖3A、B,P<0.05)。根據(jù)其在血清及血清外泌體中的表達(dá)進(jìn)行ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),AUC分別為0.862 7、0.884 9(圖3C,P<0.000 1),提示miR-642a-3p在T1DM中的表達(dá)對(duì)其診斷具有一定價(jià)值。

    圖3 miR-642a-3p在T1DM兒童血清及血清外泌體中高表達(dá)Fig.3 miR-642a-3p was overexpressed in serum and serum exosomes in T1DM children

    根據(jù)血清中miR-642a-3p的表達(dá)水平,以cut-off值(0.661 7)為界,將68例T1DM患兒分為高表達(dá)組(n=51)和低表達(dá)組(n=17);根據(jù)血清外泌體中miR-642a-3p的表達(dá)水平,以cut-off值(2.235)為界,將 68例T1DM患兒分為高表達(dá)組(n=53)和低表達(dá)組 (n=15),分別分析miR-642a-3p在血清或血清外泌體中的表達(dá)水平與T1DM患兒一般資料、血糖指數(shù)的關(guān)系(表2、表3)。結(jié)果顯示,血清及血清外泌體中miR-642a-3p表達(dá)水平與血糖濃度相關(guān)(均P<0.05),與年齡和性別均無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)。

    表2 T1DM患兒血清中miR-642a-3p的表達(dá)與一般資料、血糖指數(shù)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of miR-642a-3p expression in serum and general information, glycemic index in T1DM children

    表3 T1DM患兒血清外泌體中miR-642a-3p的表達(dá)與一般資料、血糖指數(shù)的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of miR-642a-3p expression in serum exosomes and general information, glycemic index in T1DM children

    2.4 攜帶miR-642a-3p的血清外泌體能被胰島β細(xì)胞攝取,miR-642a-3p抑制劑能抑制T1DM進(jìn)展 qRTPCR定量分析發(fā)現(xiàn),相較于3.7 mmol/L Glucose組,miR-642a-3p在高糖處理的胰島β細(xì)胞中表達(dá)水平升高(圖4A,P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,攜帶miR-642a-3p的血清外泌體可被高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞攝?。▓D4B)。與inhibitor-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-642a-3p inhibitor的外泌體中miR-642a-3p水平降低(圖4C,P<0.05)。將外泌體與胰島β細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),外泌體中的miR-642a-3p inhibitor可降低高糖培養(yǎng)胰島β細(xì)胞的凋亡率(圖4D,P<0.05),促進(jìn)其增殖活力(圖4E,P<0.05),提高GLP-1水平 (圖4F,P<0.05),同時(shí)促進(jìn)高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞分泌Ins(圖4G,P<0.05)。

    圖4 血清外泌體源性miR-642a-3p促進(jìn)T1DM的進(jìn)展Fig.4 miR-642a-3p derived from serum exosomes accelerate progression of T1DM

    2.5 HK1與miR-642a-3p存在結(jié)合位點(diǎn),且miR-642a-3p能夠調(diào)控HK1表達(dá) TargetScan靶向關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)HK1與miR-642a-3p存在特異性結(jié)合位點(diǎn)(圖5A);雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相對(duì)于miR-NC和WT-HK1共轉(zhuǎn)染組,miR-642a-3p和HK1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(圖5B)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明miR-642a-3p mimic可顯著抑制HK1的mRNA和蛋白表達(dá)(圖5C、D);借助String數(shù)據(jù)庫(kù)將HK1與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取 的T1DM(C3495814)疾 病 風(fēng) 險(xiǎn) 基 因(GCG、

    AMY2A、HLA-DQA1、CXCL10、IRF3、ITGAX、PLAAT4、ZBP1、CD68)進(jìn)行蛋白互作分析,發(fā)現(xiàn)HK1和T1DM風(fēng)險(xiǎn)基因存在中度結(jié)合關(guān)系(圖5E),提示其可能作為miR-642a-3p的一個(gè)靶基因在T1DM的進(jìn)展中發(fā)揮作用。

    圖5 HK1是miR-642a-3p的一個(gè)靶基因Fig.5 HK1 was a target gene of miR-642a-3p

    2.6 HK1能夠抑制T1DM進(jìn)展 qRT-PCR定量分析和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于3.7 mmol/L Glucose組,HK1在高糖處理的胰島β細(xì)胞中mRNA和蛋白含量均降低(圖6A、B,P<0.05)。將pcHK1轉(zhuǎn)染至高糖胰島β細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),pcHK1能夠穩(wěn)定高表達(dá)(圖6C,P<0.05),過(guò)表達(dá)HK1可降低細(xì)胞凋亡率,增加細(xì)胞增殖活力、Ins分泌水平、GLP-1濃度(圖6D~G,P<0.05),提示HK1能夠在一定程度上抑制高糖胰島β細(xì)胞的惡性表型。

    圖6 HK1能夠抑制T1DM的進(jìn)展Fig.6 HK1 can inhibit progression of T1DM

    2.7 攜帶過(guò)表達(dá)miR-642a-3p的外泌體對(duì)胰島β細(xì)胞的作用被HK1部分挽救 將轉(zhuǎn)染miR-642a-3p mimic的外泌體與高糖胰島β細(xì)胞共培養(yǎng),與mimic-NC組相比,miR-642a-3p mimic組高糖胰島β細(xì)胞中miR-642a-3p水平升高(圖7A,P<0.05),凋亡率升高(圖7B,P<0.05),增殖活力、GLP-1濃度降低(圖7C、D,P<0.05),Ins分泌減少(圖7E,P<0.05);將轉(zhuǎn)染miR-642a-3p mimic的外泌體與過(guò)表達(dá)HK1的高糖胰島β細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),相較于miR-642a-3p mimic+pcDNA3.1組,過(guò)表達(dá)HK1 miR-642a-3p水平降低(圖7A,P<0.05),過(guò)表達(dá)HK1能降低細(xì)胞凋亡率,提高細(xì)胞增殖活力、Ins分泌水平、GLP-1濃度(圖7B~E,P<0.05)。

    圖7 miR-642a-3p對(duì)胰島β細(xì)胞的作用被HK1部分挽救Fig.7 Effects of miR-642a-3p on islets β cells was partially saved by HK1

    3 討論

    既往研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在血清中的表達(dá)在T1DM患者中發(fā)生改變,血清miRNAs水平與T1DM的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島自身抗體有關(guān)[12-13]。OUNI等[14]報(bào)道了miR-205在糖尿病易感小鼠胰島中表達(dá)上調(diào),參與DM的發(fā)生發(fā)展。因此本研究通過(guò)篩查血清中差異表達(dá)的miRNAs試圖尋找有前途的疾病生物標(biāo)志物,通過(guò)對(duì)芯片的差異分析找到了在T1DM患者血清中顯著上調(diào)的miR-642a-3p。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-642a-3p同時(shí)在T1DM血清及血清外泌體中高表達(dá)。隨后將miR-642a-3p作為本研究的切入點(diǎn),試圖驗(yàn)證miR-642a-3p作為全新的靶向T1DM的生物分子靶點(diǎn)的可能。

    外周血、脂肪來(lái)源外泌體中穩(wěn)定攜帶的特異生物信息可通過(guò)調(diào)控胰島素敏感性、葡萄糖穩(wěn)態(tài)或血管內(nèi)皮功能影響T1DM進(jìn)展,而胰島素能由胰島 β細(xì)胞合成分泌[15-16]。一些外泌體中的miRNAs能夠介導(dǎo)胰腺β細(xì)胞凋亡,并可能影響T1DM的發(fā)生[17]。此前miR-299-5p被證明是β細(xì)胞生物學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子,對(duì)胰腺β細(xì)胞功能和存活具有顯著調(diào)節(jié)作用[18]。另外miR-149負(fù)調(diào)控MafA基因參與亞砷酸鹽誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞胰島素合成分泌功能障礙[19]。本研究結(jié)果表明,血清外泌體中miR-642a-3p高表達(dá),推測(cè)其對(duì)高糖培養(yǎng)的胰腺β細(xì)胞株MIN6具有調(diào)控作用。本研究隨后分析其改善細(xì)胞凋亡和功能障礙的可能作用機(jī)制,并探討了其在此過(guò)程中的調(diào)控作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-642a-3p能夠促進(jìn)MIN6細(xì)胞增殖活力,抑制其凋亡。GLP-1是一種強(qiáng)有力的胰島素促分泌劑,可增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌[20]。GLP-1水平下降會(huì)導(dǎo)致代謝綜合征,miR-194能降低GLP-1水平,并加劇GLP-1缺乏引起的代謝失調(diào),GLP-1缺乏會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和凋亡[21-22]。因此,本課題組同時(shí)測(cè)定了GLP-1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-642a-3p可促進(jìn)GLP-1表達(dá),改善GLP-1缺乏導(dǎo)致的代謝障礙,從而促進(jìn)胰島素分泌。

    為進(jìn)一步探究miR-642a-3p對(duì)T1DM的具體作用機(jī)制,本研究通過(guò)生物信息手段篩選出miR-642a-3p的下游靶基因,并將HK1納入后續(xù)研究。HK1是一種葡萄糖利用相關(guān)蛋白,十二指腸-空腸搭橋術(shù)通過(guò)激活胰島素信號(hào)和改善大腦中的葡萄糖利用率改善糖尿病進(jìn)展,HK1作為葡萄糖利用酶在治療后表達(dá)升高[23]。二甲雙胍可阻斷糖尿病小鼠心臟中HK1下調(diào),增加糖尿病心臟對(duì)葡萄糖的利用,從而對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用[24]。本研究利用雙熒光素酶分析報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-642a-3p與HK1的靶向關(guān)系,提出miR-642a-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控HK1表達(dá)影響胰島β細(xì)胞相應(yīng)功能。將MIN6細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的過(guò)表達(dá)載體后,通過(guò)將攜帶miR-642a-3p不同轉(zhuǎn)染載體的外泌體與之共培養(yǎng)后進(jìn)行一系列的功能試驗(yàn)和挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-642a-3p對(duì)胰島 β細(xì)胞功能具有損害作用,其加重T1DM的影響能夠被過(guò)表達(dá)HK1部分挽救。

    綜上所述,本課題組認(rèn)為miR-642a-3p在T1DM患兒血清和血清外泌體中表達(dá)上調(diào),且可通過(guò)靶向HK1調(diào)控高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖和凋亡,血清外泌體中miR-642a-3p為T1DM的驅(qū)動(dòng)因子,可抑制MIN6細(xì)胞中GLP-1表達(dá),進(jìn)而抑制高糖胰島β細(xì)胞胰島素分泌。本研究初步揭示了miR-642a-3p作為一種新的T1DM診斷和治療生物標(biāo)志物的可能,為今后T1DM的治療和預(yù)防研究提供重要線索。

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