干擾PAG1介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬狀態(tài)提高放射抗拒喉鱗癌的放射 敏感性研究①

張 鄂 黃 暢 費(fèi)永光 岑瑞祥 陳 沛 （武漢市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430022）

喉癌是頭頸部癌中較為常見的惡性腫瘤類型，具有較高的發(fā)病率和病死率。喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌中最常見的組織病理學(xué)類型，約占喉癌病例的85%～95%，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約能診斷出110 000例LSCC新發(fā)病例，其中有40%已處于癌癥晚期［1-2］。LSCC的主要治療方法仍是手術(shù)切除，然而部分晚期LSCC由于發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無法進(jìn)行手術(shù)根治。對于這些轉(zhuǎn)移且難以切除的LSCC病例，放射治療在局部控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。但LSCC患者在放射治療過程中往往產(chǎn)生放射抗拒，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，五年總生存率仍然較低。因此，有必要對LSCC放射抗拒發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入了解，以選擇有效的治療靶標(biāo)，提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。

鞘糖脂微結(jié)構(gòu)域1相關(guān)磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1，PAG1）是一種跨膜銜接蛋白，位于細(xì)胞膜脂筏。PAG1在抗原運(yùn)輸和免疫信號傳導(dǎo)中具有重要作用，其表達(dá)水平的增加可能具有促炎作用［4-5］。既往研究表明，PAG1在腫瘤中發(fā)揮的作用取決于其表達(dá)水平，此外，在喉癌原發(fā)性放射抗拒表型中具有關(guān)鍵調(diào)控作用［6］。鑒于此，本研究通過檢測LSCC組織中PAG1的表達(dá)水平，并將PAG1-siRNA轉(zhuǎn)染至腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，建立腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探究PAG1在介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制，為開發(fā)有效的克服LSCC放射抗拒基因治療措施奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集2018年1月至2020年6月于武漢市第一醫(yī)院接受手術(shù)切除的LSCC患者40例的腫瘤組織及鄰近癌旁組織（距腫瘤邊緣≥5 mm）。其中男性24例，女性16例，年齡43～71歲，平均年齡（48.90±5.12）歲，所有患者均為原發(fā)病例，臨床資料完整，且手術(shù)前未接受放化治療。病理切片由 2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師復(fù)查判定。在手術(shù)中取材的新鮮標(biāo)本立即于液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱保存。所有對象均簽署知情同意書，該研究方案在武漢市第一醫(yī)院倫理委員會的監(jiān)督下獲得批準(zhǔn)和實(shí)施。

1.1.2 主要材料與試劑 人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2和人外周血單核細(xì)胞系THP-1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2max由武漢市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科構(gòu)建保存；免疫組織化學(xué)染色試劑購自上海昊鑫生物公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；PMA和IL-4購自美國Sigma公司；IL-6、IL-12、IL-4及IL-10 ELISA試劑盒購自南京凱基生物公司；Transwell小室購自杭州四季青生物公司；MTT試劑液和免疫熒光染色試劑購自上海碧云天生物研究所；Annexin V-FITC/PI和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司；兔抗人CD86-PE和CD206-FITC抗體購自eBioscience公司；兔抗人PAG1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及P62購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling公司。PAG1-siRNA（5'-GCAGAGAUAUUACCAGGCUdTdT-3'）及陰性對照序列（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'）參考文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)，交由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測LSCC組織中PAG1表達(dá) 將LSCC組織及癌旁組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋，制備厚度為4 μm的連續(xù)切片。切片脫蠟脫水，加入枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，冷卻，PBS清洗，然后將切片置于3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗，滴加山羊血清封閉液，室溫封閉 30 min，滴加稀釋的兔抗人PAG1（1∶200），4 ℃下孵育過夜。次日，PBS清洗，滴加稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫繼續(xù)孵育30 min，PBS再次清洗，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，采用蘇木素復(fù)染15 s，流水反復(fù)沖洗，脫水透明，中性樹膠封片，干燥，通過光學(xué)顯微鏡觀察組織切片并拍照。PAG1陽性表達(dá)以棕色顆粒為主，電鏡下隨機(jī)選擇 5個視野，以陽性細(xì)胞結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評定。陽性細(xì)胞評分：陽性細(xì)胞比例＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。染色強(qiáng)度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相加分?jǐn)?shù)＜2分則判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測PAG1 mRNA表達(dá) 在剪碎的組織或細(xì)胞中加入Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度與濃度，選擇OD260/OD280范圍在1.8～2.0之間的樣品。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qPCR檢測基因表達(dá)，以cDNA為模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，GAPDH作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s，40個循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA相對表達(dá)量。引物交由上海生工生物公司合成，PAG1正向引物：5'-GCAGCGGACAGATGCAGAT-3'，反向引物：5'-CAGGAAGATGAGGAAGGTGATGA-3'；GAPDH正向引物：5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，反 向 引 物：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

1.2.3 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定 取生長狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個/ml，吸取100 μl接種于6孔板，參考文獻(xiàn)［8］方法誘導(dǎo)，加入含50 ng/ml PMA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞；再加入含20 ng/ml IL-4的培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h，使細(xì)胞分化為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，以未誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞作為對照組。參考文獻(xiàn)［9］方法，根據(jù)細(xì)胞是否貼壁，胞體是否出現(xiàn)偽足以及M2型巨噬細(xì)胞生物指標(biāo)CD206是否上調(diào)判斷誘導(dǎo)是否成功。收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，PBS洗滌并重懸，在細(xì)胞懸液中加入等體積血清，室溫下封閉30 min，加入兔抗人CD86-PE抗體和兔抗人CD206-FITC抗體，4 ℃下暗室孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞，并再次重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。

1.2.4 PAG1-siRNA轉(zhuǎn)染腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 取誘導(dǎo)后的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個/ml，吸取100 μl接種于96孔板，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，包括對照組、陰性對照組（NC-siRNA）、PAG1-siRNA組，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，配制PAG1-siRNA及陰性對照NC-siRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine2000復(fù)合物，在對應(yīng)分組細(xì)胞中加入復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，棄培養(yǎng)液，換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，RT-qPCR和Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 Western blot檢測PAG1與自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 在各處理組細(xì)胞中加入預(yù)冷的RIPA裂解液，置于冰上裂解，離心取上清液，根據(jù)BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。各組蛋白樣品均以30 μg進(jìn)行上樣，通過10%SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST洗膜，并置于5%山羊血清中封閉2 h，再次洗膜后，加入稀釋的兔抗人PAG1 （1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、

LC3-I（1∶1 000）及P62（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）抗體，室溫繼續(xù)孵育2 h。TBST洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑液顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察各蛋白條帶，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA檢測單核細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化 收集轉(zhuǎn)染48 h后各處理組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-12、IL-4及IL-10含量。酶標(biāo)儀測定各反應(yīng)孔在450 nm處的吸光度值（A），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔中對應(yīng)各項(xiàng)細(xì)胞因子水平。

1.2.7 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立與放射處理 以孔徑為0.4 μm的Transwell小室和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板建立Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，在上室接種處于對數(shù)期的Hep-2max細(xì)胞1×105個，下室接種不同處理組的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞2×105個。根據(jù)下室接種的細(xì)胞類型，分組包括：Hep-2max組（下室為正常培養(yǎng)基）、M2+Hep-2max組（下室為誘導(dǎo)后的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）、PAG1-siRNA-M2+Hep-2max組（下室為PAG1-siRNA轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)后的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）。將Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d，收集上室Hep-2max細(xì)胞。采用8 Gy X射線照射Hep-2max細(xì)胞24 h，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。此處以未經(jīng)8 Gy X射線照射的Hep-2max細(xì)胞作為對照組。

1.2.8 MTT法檢測細(xì)胞活性 調(diào)整各處理組Hep-2max細(xì)胞濃度，以2×104個/孔接種至96孔板，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h及72 h時，在每孔中加入20 μl MTT （5 mg/ml）試劑，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO試劑，置于搖床振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚完全溶解，酶標(biāo)儀測定各反應(yīng)孔在490 nm處的吸光值（A）。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 PBS洗滌各處理組Hep-2max細(xì)胞，以1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量1×binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個/ml，取100 μl細(xì)胞懸液，依次加入5 μl Annexin V/FITC混勻，室溫避光孵育5 min，再加入10 μl碘化丙啶（PI），混勻后室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.10 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 采用PBS洗滌各處理組Hep-2max細(xì)胞，加入4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，加入含0.3%Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，室溫避光孵育5 min，然后加入TUNEL檢測液，反復(fù)吹打至混勻，置于37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌細(xì)胞，經(jīng)涂片處理，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇 5個視野觀察，計(jì)視野下細(xì)胞總數(shù)目和TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算TUNEL陽性率。

1.2.11 免疫熒光染色檢測細(xì)胞自噬水平 采用PBS洗滌各處理組Hep-2max細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，加入含0.5%TritonX-100的PBS液通透處理15 min，PBS洗滌細(xì)胞，采用10%山羊血清封閉細(xì)胞2 h，加入稀釋的兔抗人LC3（1∶200）抗體，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌細(xì)胞，滴加熒光素FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶250）抗體，室溫避光孵育1 h，滴加DAPI試劑，避光孵育5 min進(jìn)行染核，PBS洗滌細(xì)胞，涂片處理，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野觀察，觀察蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，Graphpad Prsim 8制作統(tǒng)計(jì)圖，計(jì)量資料采用xˉ±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCC組織及癌旁組織中PAG1表達(dá)比較 通過免疫組織化學(xué)染色觀察到癌旁組織染色較淺，PAG1陽性表達(dá)率為7.50%（3/40），而LSCC腫瘤組織中可見明顯棕黃色至褐色的染色，PAG1陽性表達(dá)率達(dá)97.50%（39/40），陽性表達(dá)率較癌旁組織明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，LSCC腫瘤組織中PAG1 mRNA相對表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 喉鱗癌組織及癌旁組織中PAG1表達(dá)檢測Fig.1 Detection of PAG1 expression in LSCC tissues and adjacent tissues

2.2 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞形態(tài)與標(biāo)志物表達(dá)檢測 倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)變化，可見誘導(dǎo)前THP-1細(xì)胞邊緣清晰，呈規(guī)則的圓形或類圓形，而誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈不規(guī)則多邊形，胞體有尾足伸出，見圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86表達(dá)較對照組明顯減少，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206表達(dá)較對照組則明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2B。

圖2 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的鑒定Fig.2 Identification of tumor-associated macrophages

2.3 轉(zhuǎn)染后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中PAG1表達(dá)檢測 RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PAG1-siRNA組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中PAG1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01），而NC-siRNA組細(xì)胞中PAG1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中PAG1表達(dá)檢測Fig.3 Detection of PAG1 expression in tumor-associated macrophages of each group after transfection

2.4 轉(zhuǎn)染后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上清細(xì)胞因子表達(dá)比較 ELISA檢測結(jié)果顯示，PAG1-siRNA組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上清中IL-6、IL-12水平較對照組升高，IL-4和IL-10水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NC-siRNA組與對照組中上述細(xì)胞因子水平變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中上清細(xì)胞因子表達(dá)檢測Fig.4 Detection of cytokine expression in supernatant of each group of tumor-associated macrophages after transfection

2.5 各處理組Hep-2max細(xì)胞活性比較 MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，8 Gy X射線照射的Hep-2max細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞相比，誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAG1-siRNA與Hep-2max共培養(yǎng)后，再經(jīng)8 Gy X射線照射，細(xì)胞活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組Hep-2max細(xì)胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）

表1 各組Hep-2max細(xì)胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of OD value of Hep-2max cells in each group （±s）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with M2+Hep-2max， 2）P＜0.05.

2.6 各處理組Hep-2max細(xì)胞凋亡情況比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)8 Gy X射線照射的Hep-2max細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Hep-2max細(xì)胞和誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞相比，Hep-2max細(xì)胞和誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAG1-siRNA共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)過 8 Gy X射線照射的Hep-2max細(xì)胞TUNEL陽性率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Hep-2max細(xì)胞和誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞相比，誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAG1-siRNA共培養(yǎng)后再經(jīng)過8 Gy X射線照射的細(xì)胞TUNEL陽性率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），見圖6。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各處理組Hep-2max細(xì)胞凋亡Fig.5 Flow cytometry detection of Hep-2max cell apoptosis in each treatment group

圖6 TUNEL染色檢測各處理組Hep-2max細(xì)胞凋亡（×100）Fig.6 TUNEL staining to detect Hep-2max cell apoptosis in each treatment group （×100）

2.7 各處理組Hep-2max細(xì)胞自噬水平比較 通過免疫熒光染色觀察細(xì)胞自噬情況，可見未經(jīng)處理的對照組Hep-2max細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)，LC3表達(dá)水平高；經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度較對照組明顯減弱，LC3表達(dá)水平降低；與誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度稍暗，LC3表達(dá)水平較高；而與誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAG1-siRNA共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，LC3表達(dá)水平降低，見圖7。Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)8 Gy X射線照射的Hep-2max細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后再經(jīng)8 Gy X射線照射的細(xì)胞相比，Hep-2max細(xì)胞和誘導(dǎo)后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAG1-siRNA共培養(yǎng)再經(jīng) 8Gy X射線照射后細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖8。

圖7 免疫熒光染色檢測各處理組Hep-2max細(xì)胞自噬（×400）Fig.7 Immunofluorescence staining to detect autophagy of Hep-2max cells in each treatment group （×400）

圖8 Western blot檢測各處理組Hep-2max細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.8 Western blot detection of autophagy-related protein expression in Hep-2max cells in each treatment group

3 討論

LSCC是僅次于肺癌的第二大上呼吸道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，種族、國家、年齡及性別之間的差異造成了LSCC在各地區(qū)與各國家間的不同發(fā)病率［10］。盡管近年來包括外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法在內(nèi)的多式聯(lián)運(yùn)療法已有所改善，但患者預(yù)后仍不理想。目前，LSCC的復(fù)雜病理機(jī)制尚不明確，吸煙、飲酒、空氣污染和HPV等因素是導(dǎo)致該疾病的主要誘因［2，11］。在臨床實(shí)踐中，LSCC的短期或長期預(yù)后取決于其臨床階段，包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、原發(fā)腫瘤大小和淋巴結(jié)受累。由于疾病的不同階段具有各自的特征，僅靠分期不足以預(yù)測LSCC的預(yù)后和復(fù)發(fā)風(fēng)險。因此，闡明LSCC發(fā)生發(fā)展的重要分子發(fā)病機(jī)制，鑒別關(guān)鍵的作用因子，對探討LSCC的治療策略意義重大。

PAG1也稱Csk結(jié)合蛋白，作為一種普遍表達(dá)的跨膜蛋白，充當(dāng)Src家族激酶（SFK）的重要調(diào)節(jié)劑。PAG1在各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其表達(dá)水平在不同類型癌細(xì)胞中是可變的。PAG1表達(dá)的增加或減少反映了其在腫瘤細(xì)胞中的兩種不同途徑和功能，即具有促癌作用或抗癌作用。在某些癌細(xì)胞中，PAG1表達(dá)的下調(diào)通過MAPK/PI3K途徑的表觀遺傳組蛋白修飾和二惡英受體AhR的轉(zhuǎn)錄抑制來解釋，而PAG1表達(dá)的上調(diào)可能取決于PAG-Lyn信號體的形成以及與EBP50的相互作用［7，12］。本研究發(fā)現(xiàn)PAG1在LSCC組織中過表達(dá)，但在非腫瘤組織中表達(dá)水平較低，推測PAG1可能參與LSCC的病理過程。此外，LIN等［13］研究發(fā)現(xiàn)PAG1在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過靶向PTEN刺激鼻咽癌的增殖與轉(zhuǎn)移能力，從而加重鼻咽癌的惡性進(jìn)程，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明了敲低PAG1可阻止鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；LU等［14］報(bào)道指出PAG1在乳腺癌中高表達(dá)，并通過激活Src促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。由此可見，腫瘤組織中高表達(dá)的PAG1可能是潛在的致癌因子。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，通過多種機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞活化、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等過程。腫瘤為逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用能夠使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型發(fā)生改變，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程［15］。目前，一些研究證據(jù)表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在癌癥的放化療抗性中可能發(fā)揮重要作用。ZHENG等［16］最新研究指出在化學(xué)療法刺激下使得更多腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被募集到結(jié)直腸癌腫瘤組織中，這與化學(xué)抗藥性的發(fā)展高度相關(guān)，而由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的高水平表達(dá)的GDF15通過增強(qiáng)脂肪酸β氧化過程從而破壞腫瘤細(xì)胞的化學(xué)敏感性；ZHENG等［17］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的miR-21參與介導(dǎo)胃癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，miR-21可直接從腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胃癌細(xì)胞，通過下調(diào)PTEN增強(qiáng)PI3K/AKT信號通路激活，促進(jìn)胃癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生并抑制細(xì)胞凋亡；HUANG等［18］研究發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞不僅顯示出較強(qiáng)的自我更新能力，還通過分泌巨噬細(xì)胞抑制因子促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型的極化，并發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象與Src相關(guān)信號增加有關(guān)。以上研究均提示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可能與腫瘤細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)。同樣，本研究結(jié)果顯示，干擾PAG1表達(dá)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠增加放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2max的放射敏感性，促進(jìn)Hep-2max細(xì)胞凋亡發(fā)生。

自噬是一種高度保守的機(jī)制，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控 制系統(tǒng)的主要組成部分之一，可去除受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬與細(xì)胞凋亡間既有協(xié)同作用也有拮抗作用，兩者參與了腫瘤細(xì)胞化學(xué)抗性的穩(wěn)態(tài)［19-20］。研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬狀態(tài)的改變可能對腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性產(chǎn)生重要影響。APEL等［21］研究發(fā)現(xiàn)在下調(diào)腫瘤細(xì)胞自噬水平后，原本放射抵抗的大腸癌細(xì)胞放射敏感性明顯增加；SHAO等［22］研究結(jié)果表明結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬有關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中自噬的上調(diào)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射敏感性；GUO等［23］研究結(jié)果指出通過氯喹抑制自噬能夠改變腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞狀態(tài)，重新極化的M1型巨噬細(xì)胞顯示出對Hep-2細(xì)胞較高的吞噬活性，增加了Hep-2細(xì)胞對順鉑的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾PAG1表達(dá)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2max共培養(yǎng)后，細(xì)胞中LC3綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，同時，Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低、P62蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下調(diào)，說明細(xì)胞自噬狀態(tài)受到抑制。

綜上所述，干擾PAG1能夠抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬水平，增加與之共培養(yǎng)的放射抗拒人喉鱗癌細(xì)胞的放射敏感性。因此推測腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)狀態(tài)可能是腫瘤放射抵抗的機(jī)制之一。本研究為提高腫瘤放療效果的研究提供新思路，該作用涉及的詳細(xì)機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。