COL4A1是胃腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素①

魯修明 李小祺 徐 皓 姚寒暉 （安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，六安 237000）

胃癌是世界上第二大惡性腫瘤相關(guān)死亡原因，五年生存率低于30%，雖然手術(shù)治療、化療或輔助化療在一定程度上可提高胃癌患者生存率，但效果仍然不佳。腫瘤細(xì)胞快速增殖和遷移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因之二。目前胃癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，深入了解細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控異常有助于制定新的治療策略［1］。膠原蛋白是人體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，占蛋白質(zhì)總量的1/3。在人類蛋白譜中，至少有28種不同類型的膠原蛋白并由44個(gè)膠原基因編碼［2］。

有證據(jù)表明許多類型的膠原蛋白在不同癌型中高表達(dá)，其中Ⅳ型膠原蛋白α1（collagen typeⅣ alpha 1，COL4A1）屬于Ⅳ型膠原蛋白家族，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，是細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）中最豐富的成分［3-4］。研究表明ECM是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性行為作用［5］。因此，COL4A1可能是一個(gè)促癌基因，其在結(jié)直腸癌、膀胱癌及乳腺癌中高表達(dá)并參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［6-8］。然而，COL4A1在胃癌進(jìn)展中的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明。

本研究首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)探討胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）患者中COL4A1表達(dá)情況；然后基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建預(yù)測(cè)STAD患者預(yù)后的Nomogram模型；最后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)揭示COL4A1調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的機(jī)制。本研究對(duì)COL4A1在STAD中的分子機(jī)制進(jìn)行全面探討，可能為STAD的治療開(kāi)辟新策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-45、BGC-823和正常胃上皮細(xì)胞系GES-1（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞銀行，中國(guó)上海）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素（Gibco，Carlsbad，California）；靶向COL4A1的小干擾RNA（small interfering RNAs，si-RNA）和陰性對(duì)照（si-con）購(gòu)自Genepharma（中國(guó)上海）；si-COL4A1正向引物：5'-GATCCGGAGCGAGATGTTCAAGAAGCCTTCCTGTCAGAGCTTCTTGAACATCTCGCTCCTTT-TTG-3＇；反向引物：5'-AATTCAAAAAGGAGCGAGATGTTCAAGAAGCTCTGACAGGAAGGCTTCTTGAACATCTCGCTCCG-3＇；Lipofectamine2000（Invitrogen，Carlsbad）；cDNA合成試劑盒（TaKaRa生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，北京）；BCA試劑盒（Beyotime，Inc，中國(guó)上海）；ECL試劑盒（Beyotime，Inc）；3-2，5-二苯基四氮唑溴化銨（MTT，Solarbio，中國(guó)北京）；二甲基亞砜（Beyotime公司）；4%多聚甲醛、結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich）；Transwell小室（BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey）；本實(shí)驗(yàn)所有抗體均購(gòu)自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

1.2.1.1 COL4A1表達(dá)特點(diǎn)及與STAD患者預(yù)后關(guān)系 GEPIA［9］（http://gepia.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)COL4A1基因的表達(dá)情況并利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE54129表達(dá)矩陣進(jìn)行COL4A1基因表達(dá)驗(yàn)證。The Human Protein Atlas［10］（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL4A1在STAD組織及正常胃組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色情況。Oncomine（https://www.oncomine.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL4A1在33種泛癌中的表達(dá)情況。從TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載STAD患者基因表達(dá)矩陣及臨床信息，提取COL4A1表達(dá)量及生存狀態(tài)信息，繪制生存曲線。

1.2.1.2 COL4A1表達(dá)與STAD患者免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞是在癌癥前哨淋巴結(jié)狀態(tài)存活的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，本文擬研究該基因表達(dá) 是否與STAD患者免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)，首先從 TIMER2.0［11］（http://timer.comp-genomics.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載STAD的6種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的得分?jǐn)?shù)據(jù)，分別分析COL4A1基因表達(dá)與這些免疫細(xì)胞得分的相關(guān)性。

1.2.1.3 COL4A1基因表達(dá)與藥物敏感相關(guān)性分析 從Cellminer［12］數(shù)據(jù)庫(kù)（https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do/）下載DTPNCI60 Z評(píng)分及相應(yīng)的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)。篩選與COL4A1基因表達(dá)相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的前18個(gè)藥物，繪制散點(diǎn)圖。

1.2.1.4 基于COL4A1表達(dá)構(gòu)建Nomogram模型 在腫瘤學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中，Nomogram模型是一種常用的預(yù)測(cè)預(yù)后方法［13］。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載STAD患者基因表達(dá)矩陣及臨床信息，刪除臨床信息缺失樣本。首先單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型篩選變量。根據(jù)多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果，使用R軟件包“rms”建立Nomogram預(yù)測(cè)STAD患者一、三、 五年生存率。Nomogram提供圖形化，可通過(guò)與每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)的點(diǎn)來(lái)計(jì)算單個(gè)患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。采用校正曲線就決策曲線評(píng)估Nomogram的預(yù)測(cè)效能。

1.2.1.5 GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析 GESA分析是解釋基因表達(dá)數(shù)據(jù)的一種常用分析方法［14］?；?于LinkedOmics［15］（http://www.linkedomics.org）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的STAD中COL4A1共表達(dá)基因，采用GSEA分析進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路分析。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-45、BGC-823和正常胃上皮細(xì)胞系GES-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。當(dāng)6孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)，根據(jù)制造商方案，采用基于Lipofectamine2000的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系。RT-qPCR評(píng)估轉(zhuǎn)染48 h后的干擾效果。使用轉(zhuǎn)染效率超過(guò)80%的siRNAs。

1.2.2.2 RNA提取及RT-qPCR分析 RT-qPCR檢測(cè)COL4A1表達(dá)水平。根據(jù)制造商要求，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，并利用COL4A1和GAPDH（內(nèi)參）特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。COL4A1正向引物：5＇-CAGGCACCCCATCTGTTGAT-3＇；反向引物：5＇-CATTGCCTTGCACGTAGAGC-3＇。PCR程序如下：50 ℃ 3 min，95 ℃ 5 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s）×40個(gè)循環(huán)，40 ℃ 1 min。在PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，進(jìn)行熔融曲線分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算COL4A1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 從收獲的胃癌細(xì)胞中獲得總蛋白，采用BCA試劑盒對(duì)其濃度進(jìn)行定量。基于SDS-PAGE分離30 μg/孔蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉膜的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，使用以下一級(jí)抗體（COL4A1，1∶1 000；p-PI3K， 1∶1 000；PI3K，1∶1 000；p-AKT，1∶1 000；AKT，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000）在4 ℃下培養(yǎng)膜過(guò)夜。隨后，將HRP結(jié)合的二級(jí)抗體添加到膜中，室溫培養(yǎng)2 h。使用ECL試劑盒顯示蛋白條帶。

1.2.2.4 細(xì)胞活力評(píng)估 將轉(zhuǎn)染si-con和si-COL4A1的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，并使其黏附過(guò)夜。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：在每個(gè)培養(yǎng)4 h的孔中加入10 μl MTT，移除培養(yǎng)基并添加150 μl新鮮二甲基亞砜 10 min。使用微孔板讀取器記錄570 nm處的吸光度值（A），并使用630 nm處的吸光度值作為參考。細(xì)胞增殖率顯示：轉(zhuǎn)染組相對(duì)增殖率（%）=（A570nm-A630nm）/（對(duì)照組A570nm-A630nm）×100%。

1.2.2.5 集落形成試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染si-con和si-COL4A1的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿，并在無(wú)干擾情況下培養(yǎng)7 d。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 mim，0.5%結(jié)晶紫染色30 min。最后用Image J軟件進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2.6 傷口愈合試驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn) 細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中重復(fù)接種。一旦匯合，以無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理培養(yǎng)物12 h。第2天用10 μl的無(wú)菌微量移液管尖端刮傷單層，PBS清洗刮傷的單層。在0 h時(shí)間點(diǎn)記錄基線測(cè)量值。在24 h時(shí)測(cè)量治療后遷移到劃痕傷口間隙的情況。

在孔徑為8 μm的聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)孔室中進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。采用不含Matrigel的Transwell小室評(píng)估遷移能力；采用涂有Matrigel的侵入小室實(shí)施侵襲試驗(yàn)。將處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)到上腔，將含10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔作為引誘劑。然后，將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)24 h，用棉簽去除上表面的非遷移細(xì)胞。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下對(duì)5個(gè)不同區(qū)域附著的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0及GraphPad Prism 7.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗(yàn)繪制生存曲線。數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COL4A1在STAD中的表達(dá)情況 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)COL4A1在STAD組織中高表達(dá)（圖1A）。GEO數(shù)據(jù)集GSE54129驗(yàn)證COL4A1 mRNA在STAD組織中顯著上調(diào)（圖1B）。免疫組化結(jié)果分析COL4A1在STAD組織中陽(yáng)性表達(dá)，而在正常胃組織中陰性表達(dá)（圖1C）。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示COL4A1高表達(dá)患者的預(yù)后低于低表達(dá)患者（P＜0.05，圖2D）。此外，COL4A1在結(jié)直腸癌、淋巴瘤、頭頸部癌、胃癌、肝癌等組織中顯著上調(diào)（圖1E）。

圖1 COL4A1在STAD患者中的表達(dá)Fig.1 Expression of COL4A1 in STAD patients

2.2 COL4A表達(dá)水平與STAD患者免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 COL4A表達(dá)水平與B細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；與CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞水平呈正相關(guān)（P＜0.05，圖2）。

圖2 COL4A表達(dá)水平與STAD患者免疫浸潤(rùn)細(xì)胞散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter diagram of COL4A expression level and immune infiltrating cells in patients with STAD

2.3 COL4A1表達(dá)水平與藥物敏感相關(guān)性分析 COL4A1表達(dá)水平與較多藥物敏感相關(guān)，如生物靶向治療腫瘤藥物（樂(lè)伐替尼、埃羅替尼、依魯替尼）或治療STAD患者常見(jiàn)化療藥物紫杉醇及奧沙利鉑（圖3）。

圖3 COL4A1表達(dá)水平與藥物敏感相關(guān)性Fig.3 Correlation between COL4A1 expression level and drug sensitivity

2.4 STAD患者預(yù)后Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析 單因素及多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析結(jié)果顯示，COL4A1、年齡、TNM分期（Ⅲ期及Ⅳ期）、放射治療（否）是STAD患者病死的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表1）。

表1 STAD患者預(yù)后Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of Cox risk proportional regression model for prognosis of patients with STAD

2.5 構(gòu)建預(yù)測(cè)STAD患者預(yù)后的Nomogram模型 將COL4A1、年齡、TNM分期、放射治療作為構(gòu)建預(yù)測(cè)STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型指標(biāo)，見(jiàn)圖4A。內(nèi)部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證結(jié)果顯示 C-index為0.727（95%CI：0.651～1.000），見(jiàn)圖4B。一年（圖4C）、三年（圖4D）及五年（圖4E）決策曲線分析結(jié)果顯示，該Nomogram模型的臨床凈收益明顯高于單個(gè)指標(biāo)。

圖4 STAD患者預(yù)后Nomogram模型及預(yù)測(cè)效能評(píng)估Fig.4 Nomogram model of prognosis and evaluation of predictive efficacy in patients with STAD

2.6 GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析 選取 5 000個(gè)與COL4A1共表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析及KEGG信號(hào)通路。GO富集分析顯示COL4A1主要富集在生物調(diào)節(jié)代謝、膜、蛋白結(jié)合（圖5A）；KEGG信號(hào)通路分析顯示COL4A1主要富集在AGERAGE signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway、Cell adhesion molecules （CAMs）及cGMP-PKG signaling pathway（圖5B）。

圖5 GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析Fig.5 GO enrichment analysis and KEGG signal pathway analysis

2.7 抑制COL4A1能降低AGS細(xì)胞增殖 RT-qPCR分析正常胃上皮細(xì)胞系GES-1和人胃癌細(xì)胞系（AGS、MKN-45和BGC-823）mRNA水平。如圖6A所示，癌細(xì)胞系中COL4A1的表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞（P＜0.05），與數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出結(jié)論一致。在所有檢測(cè)癌細(xì)胞系中，AGS細(xì)胞中的COL4A1表達(dá)水平最高。因此，后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)均使用AGS細(xì)胞。

RT-qPCR和蛋白印跡法檢測(cè)AGS細(xì)胞中COL4A1 mRNA和蛋白表達(dá)評(píng)估si-COL4A1轉(zhuǎn)染效率。圖6B～D結(jié)果顯示si-COL4A1可顯著降低AGS細(xì)胞中COL4A1 mRNA和蛋白表達(dá)，干擾效率超過(guò)70%。MTT法檢測(cè)AGS細(xì)胞生長(zhǎng)活性。結(jié)果顯示，對(duì)照組相比，COL4A1基因敲降后48 h、72 h和96 h AGS細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯降低（P＜0.05，圖6E）。集落形成試驗(yàn)觀察到轉(zhuǎn)染si-COL4A1的AGS細(xì)胞形成較少克隆數(shù)（P＜0.05，圖6F～G）。提示COL4A1在AGS細(xì)胞增殖中起重要作用。

圖6 抑制COL4A1能降低AGS細(xì)胞增殖和集落形成Fig.6 Inhibition of COL4A1 can reduce AGS cell proliferation and colony formation

2.8 抑制COL4A1能降低AGS細(xì)胞遷移和侵襲能力 如圖7所示，轉(zhuǎn)染si-COL4A1的AGS細(xì)胞與對(duì)照組相比，其遷移和侵襲能力明顯減弱（P＜0.01）。提示COL4A1基因敲降能明顯抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖7 抑制COL4A1能降低AGS細(xì)胞遷移和侵襲能力Fig.7 Inhibition of COL4A1 can reduce migration and invasion of AGS cells

2.9 抑制COL4A1能抑制AGS細(xì)胞P13K/AKT信號(hào)通路 蛋白印跡法檢測(cè)P13K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵生物標(biāo)志物p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K表達(dá)水平。圖8結(jié)果顯示COL4A1基因敲降后顯著抑制AGS細(xì)胞p-AKT和p-PI3K表達(dá)（P＜0.01），但對(duì)AKT和PI3K的總表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05）。提示COL4A1通過(guò)部分調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)AGS細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

圖8 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)抑制COL4A1后對(duì)AGS細(xì)胞中p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K的表達(dá)影響Fig.8 Western blot analysis was used to detect effect of inhibition of COL4A1 on expressions of p-AKT， AKT， p-PI3K and PI3K in AGS cells

3 討論

STAD是一種異質(zhì)性疾病，在病理特征、生物學(xué)行為和基因表達(dá)譜上存在顯著差異。盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)展，但在診斷時(shí)大多處于晚期，具有較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后差［16］。因此，闡明STAD發(fā)生和疾病進(jìn)展的分子機(jī)制以確定潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)相當(dāng)重要。目前，COL4A1表達(dá)失調(diào)在幾種癌癥中均被報(bào)道，而在STAD中的生物學(xué)作用和預(yù)后價(jià)值尚不清楚［6-8］。本研究觀察到COL4A1在STAD組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組（使用TCGA、GEPIA和腫瘤數(shù)據(jù)）。此外，COL4A1表達(dá)水平與免疫浸潤(rùn)及藥物敏感性相關(guān)?；贑OL4A1表達(dá)水平及臨床數(shù)據(jù)，本研究構(gòu)建一種可以有效預(yù)測(cè)STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COL4A1對(duì)AGS細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、遷移和侵襲具有顯著抑制作用，提示COL4A1可能作為一種STAD誘導(dǎo)癌基因，具有STAD診斷、治療及評(píng)估預(yù)后的臨床價(jià)值。

COL4A1是膠原家族重要成員，是大多數(shù)結(jié)締組織和胚胎組織中ECM的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中觀察到COL4A1表達(dá)上調(diào)，可作為檢測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物［6］。膀胱癌體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，癌細(xì)胞產(chǎn)生的COL4A1通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤出芽促進(jìn)腫瘤侵襲；靶向COL4A1能抑制浸潤(rùn)模式形成［7］。乳腺癌體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了類似結(jié)論［8］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析COL4A1在STAD組織中過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)；此外，在泛癌中也發(fā)現(xiàn)許多癌型組織中COL4A1表達(dá)上調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制COL4A1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、存活、凋亡和遷移，提示COL4A1是一個(gè)促癌蛋白。癌細(xì)胞與其微環(huán)境間的相互作用是腫瘤進(jìn)展的基礎(chǔ)部分，腫瘤微環(huán)境包括多形核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞［17］。本研究通過(guò)免疫浸潤(rùn)分析發(fā)現(xiàn)COL4A表達(dá)水平與B細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)；與CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞水平呈正相關(guān)。而高免疫浸潤(rùn)與臨床藥物治療結(jié)果有關(guān)［18］。為此，本研究從Cellminer數(shù)據(jù)庫(kù)下載DTPNCI60 Z評(píng)分及相應(yīng)的COL4A1表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)COL4A1表達(dá)水平與較多藥物敏感相關(guān)，如生物靶向治療腫瘤藥物（樂(lè)伐替尼、埃羅替尼、依魯替尼）或治療STAD患者常見(jiàn)化療藥物紫杉醇及奧沙利鉑。這些結(jié)果提示COL4A1表達(dá)水平可評(píng)估STAD患者免疫浸潤(rùn)及化療效果。目前尚未出現(xiàn)靶向COL4A1的藥物，為了更好地將COL4A1應(yīng)用于臨床，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)出一種可有效預(yù)測(cè)STAD患者一年、三年及五年生存率的Nomogram模型。內(nèi)部數(shù)據(jù)集的校正曲線證實(shí)Nomogram模型具有很好的預(yù)測(cè)效能。在一年、三年及五年的決策曲線分析中，Nomogram模型預(yù)測(cè)結(jié)果的臨床凈收益高于其他指標(biāo)。COL4A1能加強(qiáng)TNM分期預(yù)測(cè)預(yù)后的能力，可對(duì)現(xiàn)有TNM分期方法進(jìn)行補(bǔ)充。

為了更加詳細(xì)地闡述COL4A1的功能機(jī)制，課題組進(jìn)行了GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析。GO富集分析顯示COL4A1主要富集在生物調(diào)節(jié)代謝、膜、蛋白結(jié)合；KEGG信號(hào)通路分析顯示COL4A1主要富集在AGE-RAGE signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway、Cell adhesion molecules （CAMs）及cGMP-PKG signaling pathway。已有研究證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、凋亡和遷移等過(guò)程。值得注意的是，STAD中PI3K/AKT信號(hào)通路被異常激活，該通路在癌細(xì)胞存活中具有關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道，胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)時(shí)，p-AKT表達(dá)顯著上調(diào)［19］。此外，抑制p-PI3K和p-AKT已經(jīng)被證明可抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲［20］。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，COL4A1基因敲降后顯著抑制AGS細(xì)胞p-AKT和p-PI3K表達(dá)，但對(duì)AKT和PI3K的總表達(dá)水平無(wú)明顯影響。提示COL4A1通過(guò)部分調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)AGS細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。COL4A1在淋巴母細(xì)胞系表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路激活成纖維細(xì)胞，提示該基因可能是預(yù)測(cè)患者癌癥遺傳易感性的候選基因，并可用于腫瘤靶向治療［21］。然而，COL4A1如何調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，該通路是否通過(guò)與其他基因結(jié)合直接或間接調(diào)控尚未明確。因此，未來(lái)應(yīng)該關(guān)注COL4A1與PI3K/AKT信號(hào)通路間的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明COL4A1表達(dá)水平是STAD患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，可作為評(píng)估預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，而本研究所構(gòu)建的Nomogram模型極有利于臨床實(shí)踐。抑制COL4A1可抑制細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。