血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的表達(dá)和意義①

黃自坤 高玉潔 羅 清 （南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）是一種病因不明的，常見(jiàn)的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，好發(fā)于15～45歲女性［1］。血清中出現(xiàn)以抗雙鏈DNA抗體（anti-double-stranded DNA antibody，anti-dsDNA）、抗Sm抗體（anti-Smith antibody，anti-Sm）為代表的多種自身抗體和多組織、多器官受累是主要臨床特征。臨床研究證實(shí)，雖然目前出現(xiàn)新型的生物制劑和更有效的SLE治療策略，但其緩解率仍不高，造成這種狀況的原因之一是缺乏高度敏感性、特異性的SLE診斷方法、疾病進(jìn)程監(jiān)測(cè)以及治療評(píng)價(jià)的方法。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circ-RNAs）是最近新發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類特殊RNA，主要由mRNA前體通過(guò)可變剪切加工產(chǎn)生，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中［2］。由于具有特殊的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，circRNA對(duì)核酸酶不敏感，因而具有良好的生物穩(wěn)定性，且特定的circ-RNA具有疾病和組織特異性，這使得circRNA在作為新型臨床生物標(biāo)志物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢(shì)［3］。已有大量的研究證實(shí)環(huán)狀RNA可用于多種疾病的診斷、療效判斷、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)等［4-6］。環(huán)狀RNA在SLE中的作用也逐漸被大眾認(rèn)識(shí)［7-8］。LI等［8］采用circRNAs芯片分析發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿circRNAs存在差異表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)血漿hsa_circ_0034398在SLE患者中明顯上調(diào)，但并未評(píng)價(jià)其臨床意義以及診斷價(jià)值。本研究旨在檢測(cè)SLE患者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和正常對(duì)照者（healthy controls，HC）血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398的表達(dá)水平，探討hsa_circ_0034398以及聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA和常規(guī)SLE指標(biāo)在SLE診斷和鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 SLE疾病組來(lái)自于2019年4月至2020年7月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的42例初診未用藥的SLE患者，SLE的診斷依據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）1997年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)［9］，并排除其他嚴(yán)重疾病。HC組來(lái)自同時(shí)期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人36例。SLE疾病組與HC組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RA疾病對(duì)照組來(lái)自于2019年4月至2020年7月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的42例初診未用藥RA患者，RA的診斷依據(jù)ACR 1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］，并排除其他嚴(yán)重疾病。各組患者的臨床特點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 SLE患者、RA患者和HC的臨床特點(diǎn)（±s）Tab.1 Clinical characteristics of patients with SLE， RA and HC （±s）

表1 SLE患者、RA患者和HC的臨床特點(diǎn)（±s）Tab.1 Clinical characteristics of patients with SLE， RA and HC （±s）

Note：Compared with HC，1）P＜0.05； compared with SLE，2）P＜0.05.

1.1.2 主要試劑、儀器 MiRNeasy Mini Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR?Premix Ex TaqTM購(gòu)自 大連寶生物 TaKaRa公司；hsa_circ_0034398及內(nèi)參基因GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 血漿總RNA提取及cDNA合成 采集SLE組、RA組和HC組空腹乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝靜脈血2 ml，6 h內(nèi)取300 μl血漿用900 μl MiRNeasy Mini Kit 試劑盒裂解液處理，置于-80 ℃冰箱保存。按MiRNeasy Mini Kit 試劑盒說(shuō)明書的標(biāo)準(zhǔn)流程提取所有受試者血漿的總RNA，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過(guò)的蒸餾水溶解RNA。取1 μl提取的總RNA，按照說(shuō)明書利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR） 采用TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR SYBR Green 法，按照試劑盒說(shuō)明書提供的檢測(cè)步驟、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行。以GAPDH基因作為內(nèi)參，采用ABI7500儀器進(jìn)行環(huán)狀RNA水平的檢測(cè)，通過(guò)熔解曲線檢測(cè)環(huán)狀RNA PCR產(chǎn)物中有無(wú)非特異性擴(kuò)增。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，采用相對(duì)定量法對(duì)RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，2-ΔΔCt計(jì)算［11］。ΔCt（疾病組）=Ct（疾病組目的環(huán)狀RNA）-Ct（疾病組GAPDH內(nèi)參基因［6］），ΔCt（對(duì)照組）=Ct（對(duì)照組目的環(huán)狀RNA）-Ct（對(duì)照組GAPDH內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（疾病組）-ΔCt（對(duì)照組）。引物序列，見(jiàn)表2。

1.2.3 SLE治療 42例初診未治療的SLE患者，其中9例初診未治療者于治療前和治療半個(gè)月后收集其空腹EDTA抗凝外周血的血漿用于環(huán)狀RNA的檢測(cè)。初診未治療的SLE患者根據(jù)病情嚴(yán)重程度選取治療方案：①病情穩(wěn)定（SLEDAI為0～4分）者維持治療；②病情輕度活動(dòng)（SLEDAI為5～9分）者采用潑尼松或糖皮質(zhì)激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來(lái)氟米特治療；③病情中度活動(dòng)（SLEDAI為10～14分）者采用糖皮質(zhì)激素+環(huán)磷酰胺/霉酚酸酯治療；④病情重度活動(dòng)（SLEDAI≥15分）者先采用糖皮質(zhì)激素沖擊加環(huán)磷酰胺，再按病情中度活動(dòng)治療方案治療。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。治療前后的環(huán)狀RNA以及血沉的比較采用Pairedt檢驗(yàn)或Wilcoxon matched pairs 檢驗(yàn)。環(huán)狀RNA與SLE實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。環(huán)狀RNA對(duì)于SLE診斷及鑒別診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)采用受試者工作特征曲線（ROC）。數(shù)據(jù)分析均使用SPSS17.0軟件進(jìn)行。以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在SLE患者和對(duì)照者中的表達(dá)水平 采用qRT-PCR檢測(cè)血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在SLE疾病組和對(duì)照組中的表達(dá)水平表明：血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在SLE組的表達(dá)水平明顯高于HC組（U=476.5，P=0.005 2，圖1A）和RA疾病對(duì)照組（U=591.0，P=0.009 4，圖1B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SLE患者和對(duì)照組血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)水平Fig.1 Expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 in SLE patients and controls

2.2 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)與SLE患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系 SLE患者常用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在SLE患者和對(duì)照者中的差異見(jiàn)表1。分析實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，SLE患者血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞百分比（neutrophil percentage，N%）呈正相關(guān)（rs=0.309 8，P=0.045 9），與單核細(xì)胞百分比（monocyte percentage，M%）（rs=-0.306 8，P=0.048 1）呈負(fù)相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達(dá)水平與SLE患者的其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)。

圖2 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)與SLE患者 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系Fig.2 Correlation of expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 in SLE patients with laboratory index

表 2 RT-qPCR引物序列Tab.2 Sequences of RT-qPCR primers

2.3 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)與治療的關(guān)系 分析治療與血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398的關(guān)系，在42例初診未治療的SLE患者中有9例于治療前和治療至少10 d后收集其血漿用于血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398的檢測(cè)，其中8例初診未治療SLE患者的血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在治療后下降，1例初診未治療SLE患者的血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在治療后升高。如圖3所示，SLE患者的血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398在治療后明顯下降（P=0.039 1）。且9例初診未治療的SLE患者的ESR在治療后明顯下降（P=0.010 1）。

圖3 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398表達(dá)、ESR與SLE 患者治療的關(guān)系Fig.3 Correlation of expression of plasma circular RNA hsa_circ_0034398 and ESR in SLE patients with treatment

2.4 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398對(duì)SLE的診斷價(jià)值 為了評(píng)估血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398對(duì)SLE診斷價(jià)值，繪制SLE疾病組區(qū)別于HC和RA疾病對(duì)照組的ROC曲線，結(jié)果如圖4所示，SLE疾病組血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398用于區(qū)別HC、RA疾病對(duì)照組和HC+RA對(duì)照組的AUC分別為0.685（圖4A）、0.665（圖4B）和0.674（圖4C）。以1.881為Cut-off，血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398診斷SLE疾病組與HC組的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)分別為57.14%、77.78%、66.67%、75.00%、60.87%、0.349；以2.658為Cut-off，血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398鑒別SLE疾病組與RA疾病對(duì)照組的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)分別為47.62%、95.24%、71.43%、90.91%、64.52%、0.429；以1.919為Cut-off，血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398鑒別SLE疾病組與HC+RA對(duì)照組的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)分別為57.14%、82.05%、73.33%、63.16%、78.05%、0.392。

圖4 血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of plasma circular RNA hsa_circ_0034398

2.5 聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398和常規(guī)指標(biāo)對(duì)SLE的診斷價(jià)值 2.4結(jié)果表明血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398對(duì)SLE 診斷Cut-off 值為＞1.881（SLEvsHC）。根據(jù)ROC曲線獲得的Cut-off值和Anti-dsDNA、Anti-Sm是否為陽(yáng)性來(lái)分析SLE患者和HC中血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-ds-DNA，Anti-Sm，聯(lián)合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA，聯(lián)合hsa_circ_0034398+Anti-Sm，聯(lián)合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm對(duì)SLE的診斷敏感度、特異性、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和約登指數(shù)。如表3所示，聯(lián)合hsa_circ_0034398+AntidsDNA的敏感度（80.95%）均高于hsa_circ_0034398（57.14%）和Anti-dsDNA（57.14%），聯(lián)合hsa_circ_0034398+Anti-Sm的敏感度（69.05%）均高于hsa_ circ_0034398（57.14%）和Anti-Sm（26.13%）。且聯(lián)合hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm（83.33%）的敏感度均高于hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA（80.95%）和hsa_circ_0034398+Anti-Sm（69.05%）。

表3 Hsa_circ_0034398、Anti-dsDNA、Anti-Sm、聯(lián)合hsa_circ_0034398+自身抗體對(duì)SLE診斷價(jià)值的分析Tab.3 Analysis of hsa_circ_0034398， Anti-dsDNA， Anti-Sm， combination hsa_circ_0034398 and autoantibodies as SLE diagnosis

如表1所示，SLE患者、RA患者、HC三組間WBC、RBC、PLT存在明顯差異。聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398、WBC、RBC和PLT對(duì)SLE診斷價(jià)值分析發(fā)現(xiàn)，SLE疾病組聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT區(qū)別HC、RA疾病對(duì)照組和HC+RA對(duì)照組的AUC分別為0.864（圖5A）、0.906（圖5B）和0.878（圖5C），均高于單項(xiàng)血漿環(huán)狀RNA的AUC（0.685、0.665、0.674）（圖4）。聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT診斷SLE疾病組與HC的敏感度和特異度分別為71.43%和91.67%；聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT鑒別SLE疾病組與RA疾病對(duì)照組的敏感度和特異度分別為88.10%和88.10%；聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT鑒別SLE疾病組與HC+RA對(duì)照組的敏感度和特異度分別為73.81%和92.31%。

圖5 聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT的ROC曲線分析Fig.5 ROC curve analysis of combined plasma circular RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT

3 討論

circRNAs在血液中可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長(zhǎng)期保存等各種處理方法均不會(huì)造成血液circRNAs的損失，比較適宜作為基本的臨床診斷標(biāo)志物［12］。近期，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試探討血漿circRNAs作為SLE診斷標(biāo)志物的可行性，如OUYANG等［13］發(fā)現(xiàn)血漿circRNA_002453在狼瘡腎中明顯上調(diào)，并且其含量與24 h蛋白尿和SLE腎損的活動(dòng)性評(píng)分呈正相關(guān)，進(jìn)一步ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)circRNA_002453的AUC可達(dá)到0.906，這表明血漿circRNAs可作為SLE的潛在新型分子標(biāo)志物。LI等［8］等采用circRNAs芯片分析發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿circRNAs存在差異表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)血漿hsa_circ_0034398在SLE患者中明顯上調(diào)，但并未評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。本文進(jìn)一步驗(yàn)證血漿hsa_circ_0034398的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在SLE患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于HC。此外，本研究還檢測(cè)RA對(duì)照組中血漿hsa_circ_0034398的含量，發(fā)現(xiàn)SLE患者的血漿hsa_circ_0034398的表達(dá)水平明顯高于RA患者。

之前的研究表明血漿circRNAs可作為SLE的疾病活動(dòng)性和疾病嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)［13］。本研究分析了血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的SLEDAI、自身抗體、ESR、C3、C4、治療等臨床與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的M%呈負(fù)相關(guān)、與N%呈正相關(guān)。可通過(guò)增加自身凋亡從而介導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生而參與SLE的致病，升高的SLE患者血漿hsa_circ_0034398與M%呈負(fù)相關(guān)，表明其可能通過(guò)影響M的凋亡而影響M%而參與SLE的致病［14］。SLE作為一種系統(tǒng)性的慢性炎癥反應(yīng)，N%可作為其炎癥程度的指標(biāo)，其在SLE患者的含量也顯著升高。并且SLE患者血漿hsa_circ_0034398與N%呈正相關(guān)，表明其可能與SLE患者的炎癥有關(guān)。此外，SLE患者的血漿hsa_circ_0034398在治療后可明顯下降。與其他血漿circRNAs研究相似，本研究結(jié)果證實(shí)了SLE患者血漿hsa_circ_0034398與SLE患者的炎癥程度以及治療相關(guān)，其可能作為評(píng)估SLE疾病嚴(yán)重程度和活動(dòng)度的指標(biāo)［7，13］。

本文采用ROC曲線分析血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398可有效的從HC和疾病對(duì)照者中診斷出SLE，這與其他研究相似［7，13］。在此基礎(chǔ)上考慮到，Anti-dsDNA和Anti-Sm是公認(rèn)的SLE診斷指標(biāo)，但其診斷敏感度較低，約為40%～50%和10%～30%［15-16］。且有研究顯示Anti-dsDNA等自身抗體聯(lián)合其他SLE診斷指標(biāo)可明顯提高其診斷敏感度和特異度［15］。因此，本研究比較血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-dsDNA，Anti-Sm，聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA，聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-Sm，聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+Anti-dsDNA+Anti-Sm的診斷效能顯示，聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+自身抗體對(duì)SLE的診斷敏感度均高于血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398，Anti-dsDNA，Anti-Sm。此外，SLE患者可涉及血液系統(tǒng)的損傷，本文的研究也證實(shí)了血液系統(tǒng)損傷指標(biāo)WBC、RBC、PLT在SLE患者、RA患者、HC對(duì)照組中存在差異。也有研究表明可采用PLT相關(guān)參數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)用于疾病診斷價(jià)值的研究［17］。鑒于此，本研究還分析聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT在SLE中的診斷效能，結(jié)果顯示聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT在區(qū)別SLE疾病組與HC、RA疾病對(duì)照組、HC+RA對(duì)照組的AUC分別為0.864、0.906、0.878；敏 感 度 分 別 為71.43%、88.10%、73.81%；特異度分別為91.67%、88.10%、92.31%。由此可以看出聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+WBC+RBC+PLT對(duì)SLE的診斷效能明顯升高。結(jié)果表明，血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398可能作為SLE診斷及鑒別診斷指標(biāo)，尤其是聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398和自身抗體、血液系統(tǒng)損傷指標(biāo)。

本文存在以下不足：SLE患者病例數(shù)不夠多，尤其是治療前后收集到血漿樣本的SLE患者。雖然采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出治療與血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398相關(guān)，但后續(xù)應(yīng)該加大SLE患者病例數(shù)，尤其是治療前后的SLE患者，進(jìn)一步證實(shí)SLE患者血漿環(huán)狀hsa_circ_0034398表達(dá)水平與治療的關(guān)系。

綜上，SLE患者血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398明顯升高，且與疾病炎癥程度以及治療相關(guān)，可能作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標(biāo)志物，尤其是聯(lián)合血漿環(huán)狀RNA hsa_circ_0034398+SLE常用指標(biāo)的診斷效能明顯升高。但hsa_circ_0034398如何調(diào)控SLE發(fā)病還不清楚，希望通過(guò)更多的研究來(lái)探討hsa_circ_0034398在SLE中所呈現(xiàn)的致病作用。