食管癌來(lái)源外泌體通過(guò)E2F4對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響①

樊 慧 陳林林 郭軍輝 李治國(guó) 王婭菲 柳 淼 王花花 趙乃闊 胡慶軍

（焦作市人民醫(yī)院消化一區(qū)，焦作 454000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球第六大 癌癥死亡原因。2018年，估計(jì)新增EC確診病例57.2萬(wàn)例，全球死亡病例50.9萬(wàn)例［1］。近幾十年來(lái)，雖然根治性手術(shù)、化療和放療等綜合治療取得了很大進(jìn)展，但是EC患者的預(yù)后仍然很差［2］。EC的發(fā)生和發(fā)展與多種因素有關(guān)，已有研究表明腫瘤免疫微環(huán)境與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17， Th17）是CD4+T細(xì)胞來(lái)源的一種T細(xì)胞亞群，其在腫瘤免疫微環(huán)境中的比例增高與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Th17細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展［4］。此外，研究表明，EC患者Th細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)高度紊亂，其外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量和IL-17含量顯著增加。Th17與腫瘤免疫和EC發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［5］。因此，阻斷CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化可能是一種新的治療EC方法。然而，EC中Th17細(xì)胞分化的機(jī)制仍很不明確。外泌體是來(lái)自不同細(xì)胞的膜泡，直徑40～100 nm。這些胞外體通過(guò)傳遞生物活性分子來(lái)促進(jìn)與鄰近細(xì)胞的相互作用［6］。已有研究證明細(xì)胞間可通過(guò)外泌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的傳遞，從而達(dá)到細(xì)胞交流的目的［7］。此外有研究報(bào)道腫瘤來(lái)源外泌體可以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞分化［8］。然而，腫瘤外泌體調(diào)控EC中Th17細(xì)胞分化的機(jī)制尚未完全確定。此外，研究表明，在腫瘤外泌體中E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員E2F4的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，該提示在腫瘤外泌體中E2F4可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用［9］。因此，本研究旨在探究EC中Th17細(xì)胞分化的機(jī)制及其機(jī)制是否與E2F4相關(guān)，以期為探究腫瘤免疫微環(huán)境與EC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系及開(kāi)發(fā)EC新的臨床治療靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 收集于焦作市人民醫(yī)院體檢的健康患者的血液樣本。所有患者未曾接受過(guò)手術(shù)、放化療及其他免疫治療；無(wú)惡性腫瘤病史；無(wú)糖尿病史；無(wú)真菌感染性疾病；無(wú)過(guò)敏性疾?。粺o(wú)傳染性疾病。

1.1.2 試劑 人食管癌細(xì)胞Eca-109購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；人正常食管上皮細(xì)胞HEEC購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；sh-NC，sh-E2F4載體及其對(duì)應(yīng)的慢病毒液和si-NC，si-E2F4均購(gòu)自云舟生物科技（廣州）有限公司； MACS磁性細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi biotec公司；TransExoTMCell Media Exosome Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Lipo3000試劑盒，IL-17A Monoclonal antibody-PE（簡(jiǎn) 稱IL-17-PE）和CD4 Monoclonal antibody-FITC（簡(jiǎn)稱CD4-FITC）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher scientific公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；E2F4、維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，ROR-γt）和IL-17抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GAPDH抗體購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D Systems公司

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離與培養(yǎng) 向血液中添加無(wú)菌PBS，以1∶1比例稀釋，充分混勻。取淋巴細(xì)胞分離液加入新的離心管內(nèi)，吸取稀釋后的血液加入管內(nèi)，淋巴細(xì)胞分離液與血液的比例為1∶2。 2 000 r/min離心20 min后，可見(jiàn)管內(nèi)出現(xiàn)明顯分層，用巴氏吸管吸取白色單個(gè)核細(xì)胞層至新的離心管內(nèi)。加入5倍量的Hank's液充分混勻，反復(fù)吹打。1 500 r/min離心10 min，重復(fù)該步驟3次。離心收集沉淀，含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將PBMC置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 免疫磁珠細(xì)胞分選法分選CD4+T細(xì)胞及純度鑒定 收集培養(yǎng)后的PBMC，加入MACS buffer重懸細(xì)胞，隨后加入CD4磁珠抗體，充分混勻。將細(xì)胞置于4 ℃條件下孵育20 min。離心收集細(xì)胞后，加入5 ml MACS buffer重懸細(xì)胞。分離柱安裝入磁場(chǎng)中，隨后將細(xì)胞懸液加至分離柱，自然流盡。再將MACS buffer加至分離柱，自然流盡，清洗分離柱2次。取下分離柱，加入MACS buffer沖下陽(yáng)性細(xì)胞，重復(fù)2次。離心收集細(xì)胞，所得沉淀即為初始CD4+T細(xì)胞。使用PBS清洗CD4+T細(xì)胞3次，最后使用PBS重懸細(xì)胞沉淀并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，向細(xì)胞懸液中加入FITC標(biāo)記的CD4熒光抗體，室溫條件下避光孵育30 min。離心收集細(xì)胞后，PBS清洗細(xì)胞2次后重懸細(xì)胞，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 初始CD4+T細(xì)胞活化及處理 分離的初始CD4+T細(xì)胞在含有CD3/CD28的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液中過(guò)夜激活。將CD4+T細(xì)胞隨機(jī)分為PBS組、HEEC-Exo組、Eca-109-Exo組、sh-NC-Exo組、sh-E2F4-Exo組，按照分組，向細(xì)胞中添加PBS、HEECExo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo，其中外泌體量為20 μg/ml。CD4+T細(xì)胞用含有20 ng/ml IL-6、2.5 ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、2 μg/ml抗IL-4和2 μg/ml抗IFN-γ的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞分化［10］。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集CD4+T細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) HEEC和Eca-109細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，胰酶液消化細(xì)胞，按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行鋪板操作。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Eca-109細(xì)胞接種于6孔板，1×106個(gè)/孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為Eca-109組、sh-NC組（sh-NC慢病毒感染）、sh-E2F4組（sh-E2F4慢病毒感染）。采用 sh-NC慢病毒液和sh-E2F4慢病毒液（1×108TU/ml）感染Eca-109細(xì)胞。感染48 h后，更換含有嘌呤霉素（6 μg/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，篩選陽(yáng)性克隆。Eca-109組細(xì)胞不進(jìn)行感染操作。隨后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中E2F4表達(dá)。將活化后的CD4+T細(xì)胞接種于 12孔板，1×106個(gè)/孔。按Lipo3000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染si-NC和si-E2F4至CD4+T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 外泌體的分離及鑒定 收集HEEC和Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃條件下300 r/min離心 30 min，去除上清液中殘留的細(xì)胞和碎片，向管內(nèi)加入EPS-C溶液顛倒混勻后，4 ℃條件下靜置過(guò)夜。4 ℃、12 000 r/min離心30 min沉淀外泌體。收集沉淀，12 000 r/min離心5 min，棄去殘留上清。加入EPS-C溶液重懸沉淀，置于-80 ℃條件下保存。將HEEC和Eca-109細(xì)胞來(lái)源外泌體命名為HEECExo、Eca-109-Exo。將穩(wěn)定表達(dá)sh-NC和sh-E2F4的Eca-109細(xì)胞來(lái)源的外泌體命名為sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo。

取HEEC-Exo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo置于銅網(wǎng)，3%磷鎢酸負(fù)染色液染色5 min，去除染色液。銅網(wǎng)晾干后，透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。取適量HEEC-Exo、Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo，PBS稀釋，0.22 μm濾器過(guò)濾后，Nanosight納米粒度顆粒跟蹤分析儀進(jìn)行外泌體粒徑檢測(cè)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白Alix、CD63和TSG101表達(dá)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化 取CD4+T細(xì)胞，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞并將細(xì)胞 密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入CD4-FITC抗體（1∶100）室溫避光孵育30 min。0.2%TritonX-100通透15 min后，加入IL-17-PE抗體（1∶100），室溫避光孵育30 min。細(xì)胞經(jīng)清洗后，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中E2F4 mRNA表達(dá) 收集HEEC、Eca-109和CD4+T細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。將提取的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，該cDNA為qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的模板。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說(shuō)明書，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算E2F4 mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR所需引物序列Tab.1 Sequence of primers required for qRT-PCR

1.2.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-17的含量 收集CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書所示，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-17的含量。

1.2.10 食管癌異種移植小鼠模型的建立 21只 5周齡雄性BALB/c裸鼠在特定的無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)。參考文獻(xiàn)［11］，建立食管癌異種移植小鼠模型。胰酶液消化穩(wěn)定表達(dá)的sh-NC或sh-E2F4的Eca-109細(xì)胞以及正常的Eca-109細(xì)胞，無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度2.5×107個(gè)/ml。取0.2 ml細(xì)胞（5×106個(gè)）接種于裸鼠右側(cè)腋背部皮下。移植瘤每3 d用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺檢查1次，腫瘤體積按以下公式計(jì)算：體積=（長(zhǎng)×寬2）/2。16 d后處死小鼠，測(cè)量腫瘤體積。

1.2.11 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中E2F4、ROR-γt和IL-17蛋白表達(dá) 收集HEEC、Eca-109和CD4+T細(xì)胞以及食管癌異種移植小鼠腫瘤，RIPA裂解液裂解細(xì)胞和組織，收集上清液，BCA法測(cè)定上清液的蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的濃度，吸取30 μg蛋白置于上樣孔內(nèi)，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉3 h，加入E2F4（1∶2 000）、ROR-γt（1∶1 000）、IL-17（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4 ℃條件下孵育過(guò)夜。加入特異性二抗稀釋液（1∶5 000），室溫條件下孵育1 h。滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS21.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，結(jié)果如圖1A所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo均呈圓形囊泡結(jié)構(gòu)；Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白Alix、CD63和TSG101的表達(dá)，結(jié)果如圖1B所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo中Alix、CD63和TSG101蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，而HEEC和Eca-109來(lái)源上清中Alix、CD63和TSG101蛋白表達(dá)不明顯；Nanosight納米粒度顆粒跟蹤分析儀進(jìn)行外泌體粒徑檢測(cè)，結(jié)果如圖1C所示，HEEC-Exo和Eca-109-Exo直徑約為100 nm。

圖1 外泌體鑒定Fig.1 Identification of exosomes

2.2 CD4+T細(xì)胞的分選鑒定 采用免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度，結(jié)果如圖2所示，CD4+T細(xì)胞比例為98.9%，細(xì)胞純度＞90%，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞比例Fig.2 Flow cytometry was used to detect proportion of CD4+T cells

2.3 EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響 應(yīng)用PBS、 HEEC-Exo或Eca-109-Exo處理CD4+T細(xì)胞，如圖3所示，與PBS組相比，HEECExo組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與HEEC-Exo組相比，Eca-109-Exo組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量明顯升高（P＜0.05）。

圖3 EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響Fig.3 Effect of exosomes derived from EC on differentiation of CD4+ T cells into Th17 cells

2.4 EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)HEEC和Eca-109細(xì)胞中E2F4表達(dá)，結(jié)果如圖4A、B所示，與HEEC組相比，Eca-109組細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。

應(yīng)用PBS、HEEC-Exo、Eca-109-Exo處理CD4+T細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)，結(jié)果如圖4C、D所示，與PBS組相比，HEEC-Exo組CD4+T細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與HEEC-Exo組相比，Eca-109-Exo組CD4+T細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

圖4 EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)的影響Fig.4 Effect of exosomes derived from EC on expression of E2F4 in CD4+T cells

2.5 sh-E2F4通過(guò)EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)的影響 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系發(fā)光情況，結(jié)果如圖5A所示，sh-E2F4組和sh-NC組細(xì)胞發(fā)光率在90%以上。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Eca-109細(xì)胞中E2F4表達(dá)，結(jié)果如圖5B、C所示，與Eca-109組相比，sh-NC組細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與sh-NC組相比，sh-E2F4組細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。

圖5 sh-NC和sh-E2F4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建Fig.5 Construction of stable transgenic sh-NC and sh-E2F4 cell lines

應(yīng)用Eca-109-Exo、sh-NC-Exo、sh-E2F4-Exo處理CD4+T細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)，結(jié)果如圖6A、B所示，與Eca-109-Exo組相比，sh-NC-Exo組細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與sh-NC-Exo組相比，sh-E2F4-Exo組細(xì)胞中E2F4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 sh-E2F4通過(guò)EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)的影響Fig.6 Effect of sh-E2F4 on expression of E2F4 in CD4+T cells through exosomes derived from EC

2.6 sh-E2F4通過(guò)EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響 應(yīng)用Eca-109-Exo 、sh-NCExo、sh-E2F4-Exo處理CD4+T細(xì)胞，結(jié)果如圖7所示，與Eca-109-Exo組相比，sh-NC-Exo組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與sh-NC-Exo組相比，sh-E2F4-Exo組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量均明顯降低（P＜0.05）。

圖7 sh-E2F4通過(guò)EC來(lái)源外泌體對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響Fig.7 Effect of sh-E2F4 on differentiation of CD4+T cells into Th17 cells through exosomes derived from EC

2.7 EC來(lái)源外泌體通過(guò)E2F4對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響 應(yīng)用si-E2F4沉默CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)量，PBS和Eca-109-Exo處理CD4+T細(xì)胞。Western blot檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中E2F4的表達(dá)，結(jié)果如圖8A，與si-NC PBS組相比，si-E2F4 PBS組CD4+T細(xì)胞中E2F4 蛋白表達(dá)明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與si-NC Eca-109-Exo組相比，si-E2F4 Eca-109-Exo組CD4+T細(xì)胞中E2F4蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（如圖8B），與si-NC PBS組相比，si-E2F4 PBS組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與si-NC Eca-109-Exo組相比，si-E2F4 Eca-109-Exo組CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例明顯降低 （P＜0.001）。

圖8 EC來(lái)源外泌體通過(guò)E2F4對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響Fig.8 Effect of E2F4 on differentiation of CD4+T cells to Th17 cells by exosomes from EC

2.8 sh-E2F4抑制小鼠食管癌的生長(zhǎng)和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) 將穩(wěn)定表達(dá)sh-NC、sh-E2F4的Eca-109細(xì)胞接種于小鼠皮下，結(jié)果如圖9所示，與Eca-109組相比，sh-NC組小鼠腫瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與sh-NC組相比，sh-E2F4組小鼠腫瘤大小和E2F4、ROR-γt、IL-17蛋 白 表 達(dá) 均 明 顯 降 低（P＜0.05）。

圖9 sh-E2F4抑制小鼠EC的生長(zhǎng)和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.9 sh-E2F4 inhibited growth of mouse EC and expression of Th17 cell-related cytokines

3 討論

腫瘤免疫微環(huán)境中Th17細(xì)胞數(shù)量的增加與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。因此，有必要探討EC中Th17細(xì)胞分化的機(jī)制。在此，本研究證明了EC外泌體可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，E2F4在EC外泌體誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。EC外泌體通過(guò)將E2F4傳遞至CD4+T細(xì)胞促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。

外泌體是細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下釋放的雙層膜包裹的小囊泡，可通過(guò)不同的分子機(jī)制影響腫瘤免疫、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等［13-14］。研究表明，外泌體在腫瘤與微環(huán)境之間的信息交換中起重要作用［15］。腫瘤外泌體因在腫瘤微環(huán)境中的重要作用成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，腫瘤外泌體可以調(diào)節(jié)腫瘤中Th17細(xì)胞的分化。例如，胃癌細(xì)胞分泌的外切體可以在低糖條件下促進(jìn)miR-451從癌細(xì)胞向浸潤(rùn)性T細(xì)胞重新分布，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化［16］。鼻咽癌的相關(guān)研究表明，外泌體miR-24-3p通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖和Th17細(xì)胞分化抑制鼻咽癌疾病進(jìn)展［17］。本研究結(jié)果顯示，EC來(lái)源外泌體能上調(diào)CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例，上調(diào)Th17分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量。然而EC外泌體在Th17細(xì)胞分化中的潛在的機(jī)制尚未完全明確。

外泌體是膜包裹的納米囊泡，可以將不同的生物活性分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和microRNAs，從供體細(xì)胞運(yùn)送到受體細(xì)胞。因此，外泌體可以改變受體細(xì)胞的生理狀態(tài)［18］。研究表明，腫瘤原發(fā)部位分泌的外泌體可以被轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)化，然后這些外泌體可以介導(dǎo)多種全身病理生理過(guò)程，促進(jìn)生存、免疫抑制和轉(zhuǎn)移生態(tài)位發(fā)育［19］。研究表明，外泌體通過(guò)傳遞非編碼RNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞和基質(zhì)成分，如CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等［20］。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)和細(xì)胞死亡的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用［21］。先前的研究結(jié)果顯示，lncRNA LINC00337的過(guò)度表達(dá)可能通過(guò)招募E2F4上調(diào)爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白2而增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞自噬和對(duì)順鉑的耐藥性［22］。不難看出，E2F4在食管癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，ZHENG 等［23］的研究結(jié)果顯示，E2F4是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的指標(biāo)。此外，在肝細(xì)胞癌中，E2F4與包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，EC細(xì)胞中E2F4的表達(dá)明顯升高。EC來(lái)源外泌體可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞中E2F4的表達(dá)。敲低EC細(xì)胞中E2F4后發(fā)現(xiàn)，sh-E2F4-Exo可抑制CD4+T細(xì)胞中E2F4的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-E2F4-Exo可抑制CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、ROR-γt蛋白表達(dá)和IL-17含量。該研究結(jié)果表明，EC來(lái)源外泌體通過(guò)E2F4促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。

Th17型的免疫反應(yīng)會(huì)引發(fā)長(zhǎng)期的慢性炎癥，產(chǎn)生IL-17和其他促炎癥細(xì)胞因子，為腫瘤的發(fā)展創(chuàng)造有利的環(huán)境。這些細(xì)胞因子除了由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生外，還由免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，從而產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)，而不是誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展［24］。研究表明，Th17在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。局部晚期宮頸癌患者外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量明顯升高，而當(dāng)患者接受同步放化療后Th17細(xì)胞數(shù)量則明顯降低。同步放化療后Th17細(xì)胞數(shù)量的減少與更好的治療效果、無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總生存期相關(guān)［25］。研究表明，阿托伐他汀通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分化，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖［26］。主要由Th17細(xì)胞分泌的促炎癥細(xì)胞因子 IL-17A已被證實(shí)參與調(diào)控食管腺癌進(jìn)展。IL-17A通過(guò)激活活性氧/核因子-κB途徑促進(jìn)食管腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。該結(jié)果提示，Th17細(xì)胞可能是食管腺癌的潛在治療靶點(diǎn)［27］。本研究結(jié)果顯示，敲低E2F4后，小鼠EC移植瘤中ROR-γt和IL-17蛋白表達(dá)均明顯降低，移植瘤大小明顯降低。該研究結(jié)果表明，EC來(lái)源外泌體可能通過(guò)E2F4促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，從而促進(jìn)腫瘤疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示EC來(lái)源外泌體介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的機(jī)制可能與誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞中E2F4表達(dá)有關(guān)。該研究結(jié)果為明確EC中Th17細(xì)胞分化的機(jī)制提供了新的研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為EC的治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。