雙氫青蒿素對非細(xì)菌性慢性前列腺炎模型大鼠前列腺組織凋亡、自噬 及纖維化的影響①

王軍浩 周 巖 韓建鵬 杜 菲 馮建勇 郭 闊 陳文彬 李永章 （河北省中醫(yī)院，石家莊 050011）

非細(xì)菌性慢性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）是慢性前列腺炎最常見的類型，病因復(fù)雜、診斷困難、反復(fù)發(fā)作、治療效果不佳，甚至可導(dǎo)致男性性功能障礙及不育，對患者身心健康造成較大負(fù)面影響［1-2］。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素被硼氫化鈉還原后的衍生物，不僅具有治療瘧疾、抗腫瘤作用，還對炎癥引發(fā)的肺組織纖維化具有抑制作用［3-6］。但DHA是否影響CNP前列腺組織凋亡、自噬及纖維化尚不清楚。本研究以健康雄性SPF級SD大鼠復(fù)制CNP模型，觀察DHA對CNP模型大鼠前列腺組織凋亡、自噬及其纖維化的影響，為CNP治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠36只，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于成都達(dá)碩生物有限公司［SCXK（川）2020-030］。

1.1.2 試劑 前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA） ELISA試劑盒購自R&D公司；IFN-γ、IL-4和COX2引物序列由上海生工生物公司合成；兔單克隆抗體TGF-β1（ab215715）、兔多克隆抗體CTGF抗體（ab125943）、兔多克隆抗體Cleaved-caspase-3（ab49822）、兔多克隆抗體Cleaved-caspase-9（ab2324）、兔單克隆抗體Beclin-1（ab210498）、兔單克隆抗體LC3B（ab192890）均購自Abcam公司； Masson染色試劑盒購自南京建城生物工程研究所；MK 3全波長酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 36只健康雄性SPF級SD大鼠放入鼠籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)取6只作為空白組，剩余30只手術(shù)構(gòu)建CNP模型，空白組實行假手術(shù)。CNP模型建立后，隨機(jī)分為4組：模型組、40 mg/kg DHA組、20 mg/kg DHA組和前列康（QLK）組，每組6只。兩個DHA組分別每天灌胃40、20 mg/kg DHA，QLK組每天灌胃0.5 g/kg前列康片，連續(xù)治療1個月?？瞻捉M和模型組不采取治療，每日灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 CNP模型建立 造模前12 h大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)，造模開始時按30 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，大鼠完全昏迷后固定，剔除腹部全部毛發(fā)，消毒。無菌條件下在腹中線位置開口，將兩側(cè)睪丸分別擠出陰囊，結(jié)扎后剪斷精索血管，縫合消毒后將大鼠放入鼠籠中等待蘇醒。第2天在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇0.35 mg/kg（溶于橄欖油）， 1次/d，連續(xù)20 d。每天用碘伏擦拭傷口并肌內(nèi)注射青霉素（200 000 U/kg），注射1周。空白組行假手術(shù)處理，除不擠出陰囊和剪斷精索血管外，其余操作同CNP造模。

1.2.3 ELISA 將前列腺組織制備成勻漿，ELISA試劑盒測定前列腺組織PSA含量，按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 白細(xì)胞數(shù)檢測 稱取100 mg大鼠相同部位前列腺組織，加入400 μl無菌0.9%氯化鈉溶液研磨制成勻漿液，加入0.78 ml白細(xì)胞稀釋液，混勻，吸取10 μl混合液滴至白細(xì)胞計數(shù)池，靜置2～3 min，顯微鏡下計數(shù)四角處4個大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)。WBC（109L-1）=4個大方格內(nèi)白細(xì)胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×10。

1.2.5 RT-qPCR TRlzol法提取前列腺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測前列腺組織IFN-γ、IL-4和COX2 mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。定量PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性12 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 IHC檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加入3%H2O2浸泡10 min，蒸餾水洗滌3次，加入緩沖液蒸煮3 min，重復(fù)2次，使抗原位點(diǎn)暴露。冷卻至室溫后水洗2次，PBS清洗2次，滴加5%BSA封閉液37 ℃封閉30 min，吸干多余液體，分別滴加一抗TGF-β1（1∶500）、CTGF（1∶200） 4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG多抗室溫孵育30 min，PBS清洗3次，滴加1%SABC 37 ℃孵育30 min，PBS清洗 3次，5 min/次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片， Image-Pro Plus光密度掃描處理，計算各標(biāo)本積分光密度（integral optical density，IOD）與面積，平均光密度（AOD）=IOD/面積。

1.2.7 Masson染色 石蠟切片脫蠟至水，Weigert氏鐵蘇木素染色5 min，水洗后加入1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)，水洗，麗春紅染色5 min，漂洗后磷鉬酸處理1 min，苯胺藍(lán)液復(fù)染 2 min，1%冰醋酸處理1 min，脫水，封片，鏡檢，采用Image-Pro Plus進(jìn)行光密度掃描處理。膠原纖維、黏液呈藍(lán)色；肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。

1.2.8 TUNEL染色 按照試劑盒說明進(jìn)行TUNEL染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，Proteinase K工作液（20 μg/ml）處理20 min，加入含2%過氧化氫的PBS室溫反應(yīng)5 min，PBS漂洗2次，干燥后加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，暗濕盒中反應(yīng)1 h（37 ℃），終止反應(yīng)，PBS漂洗3次，載液覆蓋，488 nm激發(fā)光照射下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.9 Western blot 提取前列腺組織總蛋白，BCA測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9和 Beclin-1 1∶1 000稀釋，LC3 1∶2 000稀釋） 4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗37 ℃孵育1 h，ECL顯影，Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-Pro Plus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，計算各組蛋白相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性兩組間比較采用LSD分析，方差不齊時，兩組間比較采用Tamhane's分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA對CNP大鼠前列腺PSA的影響 ELISA結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠PSA水平顯著升高；與模型組相比，20、40 mg/kg DHA及QLK組CNP大鼠前列腺組織PSA水平下調(diào)，40 mg/kg DHA PSA抑制效果最好（表2）。

表2 前列腺組織PSA水平（±s）Tab.2 PSA level in prostate tissue （±s）

表2 前列腺組織PSA水平（±s）Tab.2 PSA level in prostate tissue （±s）

Note：1）P＜0.001 vs blank group； 2）P＜0.01 vs model group.

2.2 DHA對CNP大鼠前列腺組織白細(xì)胞數(shù)量的影響 鏡檢結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠前列腺組織中白細(xì)胞數(shù)顯著增加，經(jīng)20、40 mg/kg DHA及QLK治療后，CNP大鼠前列腺組織白細(xì)胞數(shù)顯著減少，40 mg/kg DHA效果最好（表3）。

表3 DHA對CNP大鼠前列腺組織白細(xì)胞數(shù)的影響（±s）Tab.3 Effect of DHA on white blood cell count in prostate tissue （±s）

表3 DHA對CNP大鼠前列腺組織白細(xì)胞數(shù)的影響（±s）Tab.3 Effect of DHA on white blood cell count in prostate tissue （±s）

Note：1）P＜0.05 vs blank group； 2）P＜0.05 vs model group.

2.3 DHA對CNP大鼠前列腺組織炎癥因子的影響 RT-qPCR結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠前列腺組織促炎因子IFN-γ和COX-2表達(dá)增加，而抗炎因子IL-4表達(dá)降低；與模型組相比，40 mg/kgDHA組和QLK組IFN-γ和COX2 mRNA表達(dá)顯著降低，IL-4 mRNA表達(dá)顯著提高，40 mg/kg DHA組和QLK組炎癥因子mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。雖然20 mg/kg DHA對CNP大鼠炎癥因子IFN-γ和COX2 mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，對IL-4 mRNA表達(dá)有上調(diào)作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 RT-qPCR檢測大鼠前列腺組織炎癥因子mRNA表達(dá)Fig.1 Inflammatory cytokines mRNA expressions in prostate tissue detected by RT-qPCR

2.4 DHA對CNP大鼠前列腺組織纖維化的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織TGF-β1和CTGF分泌顯著增加，20、 40 mg/kg DHA及QLK均能顯著抑制CNP大鼠TGF-β1和CTGF分泌，與QLK相比，20 mg/kg DHA顯著抑制TGF-β1分泌。Masson染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠前列腺膠原細(xì)胞面積百分比顯著升高，20、40 mg/kg DHA及QLK顯著降低了CNP大鼠前列腺膠原細(xì)胞面積百分比，20、40 mg/kg DHA與QLK作用差異顯著（圖2）。

圖2 前列腺組織TGF-β1、CTGF免疫組化及Masson染色Fig.2 Immunohistochemistry and Masson staining of TGF-β1 and CTGF in prostate tissue

2.5 DHA對CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡率顯著升高，20、40 mg/kg DHA及QLK治療后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，20、 40 mg/kg DHA組與QLK組差異有統(tǒng)計學(xué)意義， 40 mg/kg DHA組變化最為顯著（圖3A）。Western blot結(jié)果表明，20、40 mg/kg DHA均顯著抑制CNP大鼠前列腺組織Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)（圖3B）。

圖3 DHA對CNP模型大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of DHA on cell apoptosis of prostate tissues in CNP model rats

2.6 DHA對CNP大鼠前列腺組織自噬的影響 Western blot結(jié)果表明，CNP大鼠前列腺組織 Beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ較比空白組顯著升高，表明CNP大鼠前列腺組織自噬作用增強(qiáng)。20、40 mg/kg DHA治療后，CNP大鼠前列腺組織Beclin-1 蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ顯著降低，表明20、40 mg/kg DHA均能抑制CNP大鼠前列腺組織自噬，見圖4。

3 討論

CNP是泌尿科門診常見男科疾病之一，與男性不育、性功能障礙、前列腺增生和前列腺癌有關(guān)［7］。但CNP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療方法均存在不足，研究CNP的發(fā)病機(jī)制及治療方式對男性健康具有重要意義。DHA已被證明對多種炎癥具有防治作用，包括腸炎、肺炎等，但DHA是否對CNP有防治作用尚不清楚。本研究旨在探討DHA對CNP的抗炎作用，并探究DHA對CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

炎癥因子在CNP發(fā)展過程中具有重要作用，且CNP會導(dǎo)致PSA水平升高，白細(xì)胞數(shù)增加［8-10］。本研究中，CNP大鼠前列腺組織PSA水平和白細(xì)胞數(shù)顯著升高，促炎因子IFN-γ和COX2 mRNA表達(dá)顯著增加，抑炎因子IL-4 mRNA表達(dá)顯著降低，表明CNP模型構(gòu)建成功，20、40 mg/kg DHA及QLK促使CNP大鼠前列腺組織PSA水平和白細(xì)胞數(shù)顯著下降， 40 mg/kg DHA及QLK顯著減少IFN-γ和COX2 mRNA表達(dá)及增加IL-4 mRNA表達(dá)，但20 mg/kg DHA對IFN-γ、COX2和IL-4 mRNA表達(dá)無顯著影響，說明20 mg/kg DHA無法有效控制CNP炎癥反應(yīng)，而 40 mg/kg DHA和QLK可有效抑制CNP炎癥反應(yīng)。

組織纖維化通常是各種刺激誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)果，是炎癥引發(fā)的異常傷口愈合過程，主要產(chǎn)生大部分膠原的肌成纖維細(xì)胞過度聚集與活化，過度纖維化可導(dǎo)致器官功能退化、衰竭甚至死亡［11-12］。研究表明，TGF-β1/CTGF信號通路介導(dǎo)了CNP病理形態(tài)，是纖維化發(fā)生機(jī)制的主要通路之一［11，13］。本研究也顯示CNP大鼠前列腺組織TGF-β1/CTGF信號通路激活，發(fā)生病理性纖維化。而20、 40 mg/kg DHA及QLK均顯著降低了CNP大鼠前列腺組織TGF-β1、CTGF分泌和膠原細(xì)胞面積百分比，表明20、40 mg/kg DHA及QLK均能抑制TGF-β1/CTGF信號通路，減輕CNP大鼠前列腺組織纖維化程度。與QLK相比，20、40 mg/kg DHA均能顯著降低CNP大鼠前列腺組織纖維化程度，20 mg/kg DHA還顯著抑制了TGF-β1分泌，表明DHA比QLK抗纖維化活性更強(qiáng)，而20 mg/kg可能是DHA抗纖維化的最佳用藥劑量。

細(xì)胞凋亡是一種穩(wěn)態(tài)且非裂解的細(xì)胞死亡模式，可支持舊細(xì)胞和受損細(xì)胞協(xié)調(diào)性拆除和清除［14］。研究表明，細(xì)胞凋亡可促進(jìn)炎癥發(fā)展，因此減少細(xì)胞凋亡可能有利于減輕炎癥反應(yīng)［15］。KANG等［16］研究表明，CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞大量凋亡，而紅參具有明顯抗凋亡和抗炎作用。本研究顯示，CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞大量凋亡，與KANG等［16］結(jié)果一致，而20、40 mg/kg DHA及QLK均能顯著抑制CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡，與QLK相比，20、40 mg/kg DHA均能顯著抑制前列腺組織細(xì)胞凋亡，表明DHA比QLK抗細(xì)胞凋亡能力更強(qiáng)。caspase-3和caspase-9分別是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的啟動子和效應(yīng)子，Cleaved-caspase是caspase的活化狀態(tài)，表明細(xì)胞凋亡被激活［15］。Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白Western blot結(jié)果表明，20、40 mg/kg DHA均能顯著抑制caspase-3和caspase-9蛋白活化，從而抑制前列腺組織細(xì)胞凋亡。

基礎(chǔ)自噬水平可確保衰老和/或受損細(xì)胞器生理更新，維持應(yīng)激因素后細(xì)胞存活［17］。自噬比細(xì)胞凋亡更早，位于凋亡上游，自噬過度激活可能通過不受控制的降解過程導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17-18］。而細(xì)胞自噬受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，一般認(rèn)為Th1細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ是自噬誘導(dǎo)因子，而Th2細(xì)胞因子IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和抗炎細(xì)胞因子是自噬抑制因子，過度自噬會引起炎癥反應(yīng)［19］。本研究中，CNP大鼠前列腺組織Beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/Ⅰ顯著升高，表明CNP大鼠前列腺組織自噬作增強(qiáng)，而20、40 mg/kg DHA均能顯著抑制CNP大鼠前列腺組織Beclin-1蛋白分泌和降低LC3Ⅱ/Ⅰ，表明DHA能顯著抑制CNP大鼠前列腺組織自噬，減輕CNP細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上，DHA對CNP具有顯著抗炎和抗纖維化活性，可抑制CNP大鼠前列腺組織細(xì)胞凋亡和自噬，減輕CNP炎癥反應(yīng)。本研究中40 mg/kg DHA表現(xiàn)出了較好的抗炎作用，而20 mg/kg DHA不能有效控制CNP炎癥反應(yīng)，但抗纖維化作用最強(qiáng)，因此DHA治療CNP的有效濃度及功效還需進(jìn)一步研究。