柚皮苷調(diào)控lncRNA MEG3/Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)炎癥來(lái)源牙周膜干細(xì)胞的成骨分化

李生婷 姚毅章 趙國(guó)廷 （青海省第五人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，西寧 810007）

牙周炎是由于牙菌斑中細(xì)菌侵犯牙周支持組織而引發(fā)的一種慢性炎癥，可造成牙周支持組織進(jìn)行性破壞，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落［1-2］。目前，隨著組織工程學(xué)、干細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，牙周組織再生工程技術(shù)已經(jīng)成為牙周疾病治療的研究熱點(diǎn)［3］。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSCs）是來(lái)源于牙周組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新能力和分化潛能，是牙周組織再生工程的關(guān)鍵種子細(xì)胞之一［4］。然而，研究表明炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化能力明顯降低［5-6］。因此尋找能夠改善炎癥環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化能力的干預(yù)治療方法具有重要意義。

柚皮苷是從蕓香科植物柚、橘等果肉和果皮中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗菌等生物活性［7］。以往研究表明，柚皮苷對(duì)PDLSCs的成骨分化具有促進(jìn)作用，可能在牙周疾病治療中具有一定應(yīng)用［8-9］。但柚皮苷對(duì)炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化能力的影響及其作用機(jī)制尚不完全清楚。本文主要研究體外分離牙周炎來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells derived from periodontitis，PPDLSCs）和正常牙周組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells obtained from healthy periodontal tissues，HPDLSCs），觀察柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的影響，并探討其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集在青海省第五人民醫(yī)院行前磨牙拔除術(shù)的35例牙周炎患者的前磨牙，其中男性21例，女性14例，年齡19～27歲，平均年齡（24.68±7.54）歲；另收集29例健康者的前磨牙，其中男16例，女13例，年齡18～25歲，平均年齡（22.98±7.64）歲；牙周炎患者和健康者的性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.1.2 試劑 α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；小干擾RNA（siRNA）陰性對(duì)照組和lncRNA MEG3 siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成；柚皮苷購(gòu)自上海純優(yōu)生物公司，純度≥98%，規(guī)格10 mg；β-甘油磷酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；地塞米松購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自常州百代生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；OCN、Runx2、ALP、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、β-actin一抗和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDLSCs分離培養(yǎng) 收集1.1.1的前磨牙用75%乙醇消毒后，PBS沖洗，用手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3處的牙周膜組織，并剪成約1 mm×1 mm× 1 mm的小塊。分離培養(yǎng)PPDLSCs和HPDLSCs。將刮取的牙周膜組織塊以1 mm間距平鋪于25 ml培養(yǎng)瓶底部，無(wú)菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待多數(shù)組織塊周圍有細(xì)胞游出后，去除蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙周膜細(xì)胞，采用有限稀釋法分離純化上HPDLSCs［10］：牙周膜細(xì)胞中加入EDTA胰酶消化吹散，制成單細(xì)胞懸液，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，有限稀釋法將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為1×103～3×103個(gè)/孔，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成，挑選并標(biāo)記僅含有單個(gè)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)孔，另補(bǔ)加100 μl的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)孔中細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積的1/3～1/2時(shí)，含EDTA胰酶消化傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。第4代人牙周膜細(xì)胞，采用磁珠分離法篩選牙周膜干細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將第5代培養(yǎng)的PPDLSCs細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種至24孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，將細(xì)胞分為兩組，一組轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）陰性對(duì)照，記為si-RNA；一組轉(zhuǎn)染siRNA lncRNA MEG3，記為si-MEG3。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書，轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PPDLSCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×103個(gè)/ml，以100 μl/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分組，并分別加入柚皮苷終濃度0、10、 100 nmol/L、1、10、100 μmol/L處理，分別于處理24 h、48 h和72 h時(shí)，每孔加入20 μl的MTT溶液，反應(yīng)4 h后。終止培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液37 ℃孵育10 min，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值（OD490）。

1.2.4 成骨分化誘導(dǎo) 將正常培養(yǎng)的PPDLSCs及si-NC組、si-MEG3組的PPDLSCs，分別以5×104個(gè)/孔接種至6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞達(dá)60%融合后，每孔加入1 μmol/L柚皮苷，以不加柚皮苷為對(duì)照，室溫孵育30 min后更換礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松的α-MEM培養(yǎng)液），繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，成骨誘導(dǎo)第7天，棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，沖洗并收集細(xì)胞，檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集以上正常培養(yǎng)及處理后的HPDLSCs和PPDLSCs細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)lncRNA MEG3和成骨相關(guān)基因OCN、Runx2、ALPmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列： lncRNA MEG3正向5'-TACACCTCACGAGGGCACTA-3'，反向5'-CAGGGCTTAATGCCCAATGC-3'；OCN正向5'-CTCACTCTGCTGGCCCTGAC-3'，反向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；Runx2正向5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3'，反 向5'-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3'；ALP正向5'-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3'，反 向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正 向5'- CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3'，反 向5'-GGACTCCACGACGTACTCAG-3'。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集處理后的PPDLSCs細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白樣品濃度。將蛋白樣品放入沸水中變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶粉室溫封膜1 h。參照一抗說(shuō)明書稀釋一抗，加入稀釋后的一抗OCN（1∶1 000）、Runx2（1∶500）、ALP（1∶500）、GSK3β（1∶1 000）、 p-GSK3β（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、β-actin （1∶1 000），室溫孵育2 h，洗膜。加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，放入搖床中孵育1 h，洗膜。加入化學(xué)發(fā)光液中顯色，顯微鏡下曝光，拍照。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0，性別等計(jì)數(shù)資料用%表示，mRNA相對(duì)表達(dá)量等計(jì)量資料用±s表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷促進(jìn)PPDLSCs的增殖和成骨分化 本研究使用柚皮苷終濃度0、10、100 nmol/L、1、10、 100 μmol/L處理PPDLSCs，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，處理24 h時(shí)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化（P＞0.05），處理48 h和72 h時(shí)100 nmol/L和 1 μmol/L組細(xì)胞的吸光度值與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05），而10 μmol/L和100 μmol/L組細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制（P＜0.05）。見表1。1 μmol/L柚皮苷處理對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用柚皮苷1 μmol/L處理細(xì)胞。

表1 不同濃度柚皮苷對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs （±s）

表1 不同濃度柚皮苷對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin 1 μmol/L group.

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 對(duì)照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group （±s）

表2 對(duì)照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group.

圖1 Western blot檢測(cè)OCN、Runx2和ALP蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of OCN， Runx2 and ALP were detected by Western blot

2.2 柚皮苷上調(diào)PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)HPDLSCs和PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)，結(jié)果顯示，與HPDLSCs比較，PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。與對(duì)照組比較，柚皮苷組 PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細(xì)胞中低表達(dá)（±s）Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs （±s）

表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細(xì)胞中低表達(dá)（±s）Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs HPDLSCs group.

表4 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達(dá)（±s）Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs （±s）

表4 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達(dá)（±s）Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group.

2.3 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MEG3組PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MEG3組PPDLSCs細(xì)胞在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs （±s）

表5 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs （±s）

Note：1）P＜0.05 vs si-NC group.

2.4 抑制lncRNA MEG3逆轉(zhuǎn)柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用 本研究構(gòu)建抑制lncRNA MEG3表達(dá)的PPDLSCs。RT-qPCR結(jié)果顯示，與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示，與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表6。

表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group （±s）

表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)（±s）Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin+si-NC group.

圖2 Western blot檢測(cè)OCN、Runx2和ALP蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of OCN， Runx2 and ALP were detected by Western blot

2.5 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，柚皮苷組PPDLSCs中p-GSK3β、 β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與柚皮苷組+si-NC組比較，柚皮苷+ si-MEG3組PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、表7。

圖3 Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of Wnt/β-catenin pathway was detected by Western blot

表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)（±s）Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group （±s）

表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)（±s）Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group （±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs naringin+si-NC group.

3 討論

牙周炎是成年人口腔失牙的主要原因之一，近年來(lái)中醫(yī)藥治療通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境，促進(jìn)牙周組織修復(fù)，在牙周疾病治療中受到廣泛關(guān)注［11-12］。hPDLSCs是一種來(lái)源于牙周膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化形成骨組織、軟骨組織等，是牙周組織再生和修復(fù)最理想的種子細(xì)胞，然而由于缺氧、炎癥等微環(huán)境變化，均可損害PDLSCs的多重分化潛能［13］。

柚皮苷作為一種天然存在的黃酮類化合物，已被證實(shí)能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞活性、促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［14-16］。本研究分離培養(yǎng)PPDLSCs，使用不同濃度柚皮苷處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低濃度的柚皮苷能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度的柚皮苷則抑制細(xì)胞增殖，其中 1 μmol/L柚皮苷處理時(shí)細(xì)胞的增殖活性最佳。進(jìn)一步對(duì)PPDLSCs進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)1 μmol/L柚皮苷處理能夠促進(jìn)PPDLSCs中成骨相關(guān)基因的表達(dá)，說(shuō)明柚皮苷能夠促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化能力。然而，柚皮苷通過(guò)哪些途徑促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化尚未探明。

lncRNA是一種非編碼RNA，沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的能力，但可調(diào)控生理和病理過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與了包括癌癥、炎癥、心血管系統(tǒng)等疾病的發(fā)生和發(fā)展［17-18］。近來(lái)研究表明，lncRNA在牙周炎組織中表達(dá)失調(diào)可能參與了牙周炎的發(fā)病過(guò)程，如WANG等［19］報(bào)道lncRNA-POIR在牙周炎患者PPDLSCs中表達(dá)下調(diào)，功能研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-POIR能夠正向調(diào)控PPDLSCs和HPDLSCs的成骨分化能力；HAN等［20］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1在牙周炎患者牙周韌帶組織和脂多糖誘導(dǎo)的hPDLCs中表達(dá)降低，干擾lncRNA TUG1可以調(diào)控炎癥條件下hPDLCs的增殖和分化；LIU等［21］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3在牙周炎組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)lncRNA MEG3能夠促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化。

本研究結(jié)果，與HPDLSCs比較，PPDLSCs中l(wèi)nc-RNA MEG3表達(dá)下調(diào)，與LIU等［21］研究結(jié)果基本一致。此外，本研究在柚皮苷處理的PPDLSCs中發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3的表達(dá)升高，提示柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能與上調(diào)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步在PPDLSCs中敲除lncRNA MEG3的表達(dá)進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA MEG3后抑制了PPDLSCs細(xì)胞增殖，并減弱了柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活是炎癥環(huán)境下hPDLSCs成骨分化抑制的重要原因之一［22-23］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，柚皮苷處理的PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明柚皮苷能夠抑制PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，而敲減lncRNA MEG3后柚皮苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的抑制作用減弱，說(shuō)明柚皮苷可能通過(guò)上調(diào)lncRNA MEG3，進(jìn)而抑制Wnt/ β-catenin信號(hào)通路活性，從而促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化。

綜上所述，本研究證實(shí)柚皮苷能夠促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化，并發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA MEG3表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是柚皮苷發(fā)揮作用的機(jī)制之一。