李生婷 姚毅章 趙國(guó)廷 (青海省第五人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心,西寧 810007)
牙周炎是由于牙菌斑中細(xì)菌侵犯牙周支持組織而引發(fā)的一種慢性炎癥,可造成牙周支持組織進(jìn)行性破壞,最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落[1-2]。目前,隨著組織工程學(xué)、干細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展,牙周組織再生工程技術(shù)已經(jīng)成為牙周疾病治療的研究熱點(diǎn)[3]。人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cell,hPDLSCs)是來源于牙周組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有自我更新能力和分化潛能,是牙周組織再生工程的關(guān)鍵種子細(xì)胞之一[4]。然而,研究表明炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化能力明顯降低[5-6]。因此尋找能夠改善炎癥環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化能力的干預(yù)治療方法具有重要意義。
柚皮苷是從蕓香科植物柚、橘等果肉和果皮中提取的一種黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗菌等生物活性[7]。以往研究表明,柚皮苷對(duì)PDLSCs的成骨分化具有促進(jìn)作用,可能在牙周疾病治療中具有一定應(yīng)用[8-9]。但柚皮苷對(duì)炎癥狀態(tài)下PDLSCs的成骨分化能力的影響及其作用機(jī)制尚不完全清楚。本文主要研究體外分離牙周炎來源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells derived from periodontitis,PPDLSCs)和正常牙周組織來源的牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells obtained from healthy periodontal tissues,HPDLSCs),觀察柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的影響,并探討其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
1.1 資料
1.1.1 一般資料 收集在青海省第五人民醫(yī)院行前磨牙拔除術(shù)的35例牙周炎患者的前磨牙,其中男性21例,女性14例,年齡19~27歲,平均年齡(24.68±7.54)歲;另收集29例健康者的前磨牙,其中男16例,女13例,年齡18~25歲,平均年齡(22.98±7.64)歲;牙周炎患者和健康者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
1.1.2 試劑 α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;小干擾RNA(siRNA)陰性對(duì)照組和lncRNA MEG3 siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成;柚皮苷購(gòu)自上海純優(yōu)生物公司,純度≥98%,規(guī)格10 mg;β-甘油磷酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;地塞米松購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自常州百代生物科技有限公司;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;OCN、Runx2、ALP、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、β-actin一抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。
1.2 方法
1.2.1 hPDLSCs分離培養(yǎng) 收集1.1.1的前磨牙用75%乙醇消毒后,PBS沖洗,用手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3處的牙周膜組織,并剪成約1 mm×1 mm× 1 mm的小塊。分離培養(yǎng)PPDLSCs和HPDLSCs。將刮取的牙周膜組織塊以1 mm間距平鋪于25 ml培養(yǎng)瓶底部,無菌蓋玻片覆蓋組織塊,加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液,置于37 ℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待多數(shù)組織塊周圍有細(xì)胞游出后,去除蓋玻片,常規(guī)培養(yǎng),每3 d更換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙周膜細(xì)胞,采用有限稀釋法分離純化上HPDLSCs[10]:牙周膜細(xì)胞中加入EDTA胰酶消化吹散,制成單細(xì)胞懸液,常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)后,有限稀釋法將細(xì)胞接種于96孔板中,密度為1×103~3×103個(gè)/孔,置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成,挑選并標(biāo)記僅含有單個(gè)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)孔,另補(bǔ)加100 μl的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),待培養(yǎng)孔中細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積的1/3~1/2時(shí),含EDTA胰酶消化傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。第4代人牙周膜細(xì)胞,采用磁珠分離法篩選牙周膜干細(xì)胞。
1.2.2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將第5代培養(yǎng)的PPDLSCs細(xì)胞,以1×106個(gè)/孔接種至24孔板中,當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),將細(xì)胞分為兩組,一組轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)陰性對(duì)照,記為si-RNA;一組轉(zhuǎn)染siRNA lncRNA MEG3,記為si-MEG3。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000試劑說明書,轉(zhuǎn)染48 h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PPDLSCs細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×103個(gè)/ml,以100 μl/孔接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,將細(xì)胞分組,并分別加入柚皮苷終濃度0、10、 100 nmol/L、1、10、100 μmol/L處理,分別于處理24 h、48 h和72 h時(shí),每孔加入20 μl的MTT溶液,反應(yīng)4 h后。終止培養(yǎng),吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液,然后每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液37 ℃孵育10 min,然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD490)。
1.2.4 成骨分化誘導(dǎo) 將正常培養(yǎng)的PPDLSCs及si-NC組、si-MEG3組的PPDLSCs,分別以5×104個(gè)/孔接種至6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h,至細(xì)胞達(dá)60%融合后,每孔加入1 μmol/L柚皮苷,以不加柚皮苷為對(duì)照,室溫孵育30 min后更換礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松的α-MEM培養(yǎng)液),繼續(xù)培養(yǎng),每3 d更換1次培養(yǎng)液,成骨誘導(dǎo)第7天,棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)液,沖洗并收集細(xì)胞,檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
1.2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集以上正常培養(yǎng)及處理后的HPDLSCs和PPDLSCs細(xì)胞,采用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度法檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度,然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR反應(yīng),分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)lncRNA MEG3和成骨相關(guān)基因OCN、Runx2、ALPmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列: lncRNA MEG3正向5'-TACACCTCACGAGGGCACTA-3',反向5'-CAGGGCTTAATGCCCAATGC-3';OCN正向5'-CTCACTCTGCTGGCCCTGAC-3',反向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3';Runx2正向5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3',反 向5'-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3';ALP正向5'-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3',反 向5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3';U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';GAPDH正 向5'- CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3',反 向5'-GGACTCCACGACGTACTCAG-3'。
1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集處理后的PPDLSCs細(xì)胞,提取總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白樣品濃度。將蛋白樣品放入沸水中變性,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂奶粉室溫封膜1 h。參照一抗說明書稀釋一抗,加入稀釋后的一抗OCN(1∶1 000)、Runx2(1∶500)、ALP(1∶500)、GSK3β(1∶1 000)、 p-GSK3β(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、β-actin (1∶1 000),室溫孵育2 h,洗膜。加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,放入搖床中孵育1 h,洗膜。加入化學(xué)發(fā)光液中顯色,顯微鏡下曝光,拍照。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0,性別等計(jì)數(shù)資料用%表示,mRNA相對(duì)表達(dá)量等計(jì)量資料用±s表示,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 柚皮苷促進(jìn)PPDLSCs的增殖和成骨分化 本研究使用柚皮苷終濃度0、10、100 nmol/L、1、10、 100 μmol/L處理PPDLSCs,MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,結(jié)果顯示,處理24 h時(shí)細(xì)胞增殖能力無明顯變化(P>0.05),處理48 h和72 h時(shí)100 nmol/L和 1 μmol/L組細(xì)胞的吸光度值與對(duì)照組比較明顯升高(P<0.05),而10 μmol/L和100 μmol/L組細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制(P<0.05)。見表1。1 μmol/L柚皮苷處理對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用柚皮苷1 μmol/L處理細(xì)胞。
表1 不同濃度柚皮苷對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響(±s)Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs (±s)
表1 不同濃度柚皮苷對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響(±s)Tab.1 Effects of naringin at different concentrations on proliferation of PPDLSCs (±s)
Note:1)P<0.05 vs control group; 2)P<0.05 vs naringin 1 μmol/L group.
RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,柚皮苷組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。
表2 對(duì)照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)(±s)Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group (±s)
表2 對(duì)照組和柚皮苷組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)(±s)Tab.2 Expression of osteogenic differentiation related genes in PPDLSCs in control group and naringin group (±s)
Note:1)P<0.05 vs control group.
圖1 Western blot檢測(cè)OCN、Runx2和ALP蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of OCN, Runx2 and ALP were detected by Western blot
2.2 柚皮苷上調(diào)PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)HPDLSCs和PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá),結(jié)果顯示,與HPDLSCs比較,PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。與對(duì)照組比較,柚皮苷組 PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。
表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細(xì)胞中低表達(dá)(±s)Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs (±s)
表3 lncRNA MEG3在PPDLSCs細(xì)胞中低表達(dá)(±s)Tab.3 lncRNA MEG3 was low expressed in PPDLSCs (±s)
Note:1)P<0.05 vs HPDLSCs group.
表4 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達(dá)(±s)Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs (±s)
表4 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3在PPDLSCs中的表達(dá)(±s)Tab.4 Naringin up-regulates expression of lncRNA MEG3 in PPDLSCs (±s)
Note:1)P<0.05 vs control group.
2.3 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-MEG3組PPDLSCs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-MEG3組PPDLSCs細(xì)胞在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。
表5 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響(±s)Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs (±s)
表5 抑制lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs細(xì)胞增殖的影響(±s)Tab.5 Inhibition of lncRNA MEG3 on proliferation of PPDLSCs (±s)
Note:1)P<0.05 vs si-NC group.
2.4 抑制lncRNA MEG3逆轉(zhuǎn)柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用 本研究構(gòu)建抑制lncRNA MEG3表達(dá)的PPDLSCs。RT-qPCR結(jié)果顯示,與柚皮苷組+si-NC組比較,柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Western blot結(jié)果顯示,與柚皮苷組+si-NC組比較,柚皮苷+si-MEG3組PPDLSCs中OCN、Runx2和ALP蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表6。
表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)(±s)Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group (±s)
表6 各組PPDLSCs中成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)(±s)Tab.6 Expression of genes related to osteogenic differentiation in PPDLSCs of each group (±s)
Note:1)P<0.05 vs control group; 2)P<0.05 vs naringin+si-NC group.
圖2 Western blot檢測(cè)OCN、Runx2和ALP蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of OCN, Runx2 and ALP were detected by Western blot
2.5 柚皮苷上調(diào)lncRNA MEG3對(duì)PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,柚皮苷組PPDLSCs中p-GSK3β、 β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與柚皮苷組+si-NC組比較,柚皮苷+ si-MEG3組PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、表7。
圖3 Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of Wnt/β-catenin pathway was detected by Western blot
表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)(±s)Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group (±s)
表7 各組PPDLSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)(±s)Tab.7 Relative expression of Wnt/β-catenin pathway protein in PPDLSCs of each group (±s)
Note:1)P<0.05 vs control group; 2)P<0.05 vs naringin+si-NC group.
牙周炎是成年人口腔失牙的主要原因之一,近年來中醫(yī)藥治療通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境,促進(jìn)牙周組織修復(fù),在牙周疾病治療中受到廣泛關(guān)注[11-12]。hPDLSCs是一種來源于牙周膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,可分化形成骨組織、軟骨組織等,是牙周組織再生和修復(fù)最理想的種子細(xì)胞,然而由于缺氧、炎癥等微環(huán)境變化,均可損害PDLSCs的多重分化潛能[13]。
柚皮苷作為一種天然存在的黃酮類化合物,已被證實(shí)能夠促進(jìn)牙周膜細(xì)胞活性、促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞增殖和分化,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14-16]。本研究分離培養(yǎng)PPDLSCs,使用不同濃度柚皮苷處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)低濃度的柚皮苷能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,而高濃度的柚皮苷則抑制細(xì)胞增殖,其中 1 μmol/L柚皮苷處理時(shí)細(xì)胞的增殖活性最佳。進(jìn)一步對(duì)PPDLSCs進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)1 μmol/L柚皮苷處理能夠促進(jìn)PPDLSCs中成骨相關(guān)基因的表達(dá),說明柚皮苷能夠促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化能力。然而,柚皮苷通過哪些途徑促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化尚未探明。
lncRNA是一種非編碼RNA,沒有編碼蛋白質(zhì)的能力,但可調(diào)控生理和病理過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與了包括癌癥、炎癥、心血管系統(tǒng)等疾病的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。近來研究表明,lncRNA在牙周炎組織中表達(dá)失調(diào)可能參與了牙周炎的發(fā)病過程,如WANG等[19]報(bào)道lncRNA-POIR在牙周炎患者PPDLSCs中表達(dá)下調(diào),功能研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-POIR能夠正向調(diào)控PPDLSCs和HPDLSCs的成骨分化能力;HAN等[20]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA TUG1在牙周炎患者牙周韌帶組織和脂多糖誘導(dǎo)的hPDLCs中表達(dá)降低,干擾lncRNA TUG1可以調(diào)控炎癥條件下hPDLCs的增殖和分化;LIU等[21]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA MEG3在牙周炎組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)lncRNA MEG3能夠促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化。
本研究結(jié)果,與HPDLSCs比較,PPDLSCs中l(wèi)nc-RNA MEG3表達(dá)下調(diào),與LIU等[21]研究結(jié)果基本一致。此外,本研究在柚皮苷處理的PPDLSCs中發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3的表達(dá)升高,提示柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能與上調(diào)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步在PPDLSCs中敲除lncRNA MEG3的表達(dá)進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA MEG3后抑制了PPDLSCs細(xì)胞增殖,并減弱了柚皮苷對(duì)PPDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用。
Wnt/β-catenin信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活是炎癥環(huán)境下hPDLSCs成骨分化抑制的重要原因之一[22-23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,柚皮苷處理的PPDLSCs中p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低,說明柚皮苷能夠抑制PPDLSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性,而敲減lncRNA MEG3后柚皮苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的抑制作用減弱,說明柚皮苷可能通過上調(diào)lncRNA MEG3,進(jìn)而抑制Wnt/ β-catenin信號(hào)通路活性,從而促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化。
綜上所述,本研究證實(shí)柚皮苷能夠促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化,并發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA MEG3表達(dá),抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是柚皮苷發(fā)揮作用的機(jī)制之一。