miR-98-5p靶向HIF1AN對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡及炎癥因子的影響

蔣剛健 胡 淼 胡東坡 （漯河市中心醫(yī)院檢驗科，漯河 462000）

支氣管上皮細胞是維持機體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，可防御微生物等病原菌感染，支氣管上皮細胞損傷與感染性疾病發(fā)生密切相關(guān)，而炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等是導致支氣管上皮細胞損傷的重要原因，如何減輕支氣管上皮細胞損傷已成為研究重點，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并可作為支氣管上皮細胞損傷體外研究的重要誘導因子［1-2］。支氣管上皮細胞損傷的機制尚未闡明。微小RNA（miRNA）在支氣管上皮細胞中表達異常，并參與 支氣管上皮細胞損傷過程［3-4］。支氣管哮喘患兒miR-98-5p表達降低，并參與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展過程［5］。starbase預測顯示缺氧誘導因子1-α抑制劑（HIF1AN）可能是miR-98-5p的靶基因，在心肌缺血再灌注損傷中表達升高，抑制其表達可減輕心肌缺血再灌注損傷［6］。本研究主要探討miR-98-5p與HIF1AN對LPS誘導的支氣管上皮細胞損傷的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常支氣管上皮細胞16-HBE購自美國ATCC細胞庫；LPS購自北京百奧萊博科技有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1α檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自北京宜科思源科技有限公司；Trizol試劑購自上海索寶生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR檢測試劑盒購自上海迪奧生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；miR-98-5p mimics及其陰性對照miR-NC、 si-HIF1AN及其陰性對照si-NC、anti-miR-98-5p及其陰性對照anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；兔抗人Cleaved-caspase-3抗體購自美國CST；兔抗人HIF1AN、BNIP3抗體購自美國Abcam；二抗購自武漢艾美捷。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 16-HBE細胞以5×103個/孔接種于96孔板，加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h， 記為LPS組［7］。正常培養(yǎng)的細胞記為NC組。參照Lipofectamine2000試劑說明分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、si-NC、si-HIF1AN、pcDNA-NC、pcDNAHIF1AN、miR-98-5p mimics與pcDNA-NC、miR-98-5p mimics與pcDNA-HIF1AN轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞，加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液刺激24 h，分別記為miR-NC+LPS組、miR-98-5p+LPS組、si-NC+LPS組、si-HIF1AN+LPS組、pcDNA-NC+LPS組、pcDNA-HIF1AN+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組、miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞miR-98-5p、HIF1AN mRNA表達 取各組16-HBE細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄過程嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng)，按照試劑盒說明書操作，7500Fast型熒光定量PCR儀檢測miR-98-5p、HIF1AN mRNA相對表達。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組16-HBE細胞加入預冷PBS洗滌，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，按照凋亡試劑盒說明書檢測細胞 凋亡率。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平 取各組細胞上清，ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-98-5p與HIF1AN的靶向關(guān)系 分別構(gòu)建野生型載體WTNek6與突變型載體MUT-Nek6，分別將miR-NC、miR-98-5p mimics與WT-HIF1AN、MUT-HIF1AN共轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測細胞熒光素酶活性。分別將miR-NC、miR-98-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-98-5p轉(zhuǎn)染至16-HBE細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，Western blot檢測HIF1AN蛋白水平。

1.2.6 Western blot檢測HIF1AN、Cleaved-caspase-3、BNIP3蛋白表達 16-HBE細胞加入500 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加入兔抗人Cleaved-caspase-3、兔抗人HIF1AN、BNIP3一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對16-HBE細胞miR-98-5p和HIF1AN表達的影響 與NC組比較，LPS組miR-98-5p表達降低（P＜0.05），HIF1AN mRNA及蛋白表達升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 LPS對人正常支氣管上皮細胞16-HBE miR-98-5p 和HIF1AN表達的影響Fig.1 Effect of LPS on expressions of miR-98-5p and HIF1AN in human normal bronchial epithelial cells 16-HBE

2.2 過表達miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與NC組比較，LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，miR-98-5p+LPS組凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 過表達miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡 和炎癥因子的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR-98-5p on apoptosis and inflammatory factors in LPS-induced 16-HBE cells

2.3 低表達HIF1AN對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與si-NC+LPS組比較，si-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 miR-98-5p靶向HIF1AN starbase預測顯示，miR-98-5p與HIF1AN存在結(jié)合位點（圖4A）。miR-98-5p過表達可降低野生型載體WT-HIF1AN熒光素酶活性（P＜0.05）；miR-98-5p可負調(diào)控HIF1AN表達（P＜0.05，圖4B、C）。

圖4 miR-98-5p靶向調(diào)控HIF1AN表達Fig.4 miR-98-5p targeting regulates HIF1AN expression

2.5 過表達HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對LPS誘導的16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響 與pcDNANC+LPS組比較，pcDNA-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05）；與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較，miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達及TNF-α、IL-6、IL-1α水平升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 過表達HIF1AN可逆轉(zhuǎn)miR-98-5p對LPS誘導的 16-HBE細胞凋亡和炎癥因子的影響Fig.5 Overexpression of HIF1AN reverses effects of miR-98-5p on LPS-induced 16-HBE cells apoptosis and inflammatory factors

2.6 HIF-1α/BNIP3信號通路蛋白表達 與NC組比較，LPS組BNIP3蛋白表達升高（P＜0.05）；與miRNC+LPS組比較，miR-98-5p+LPS組BNIP3蛋白表達降低（P＜0.05）；與miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS組比較，miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS組BNIP3蛋白表達升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 BNIP3蛋白表達Fig.6 BNIP3 protein expression

3 討論

miRNA在支氣管細胞損傷中表達異常并參與細胞損傷過程，如miR-Let-7f-1-3p通過靶向FOXO1抑制煙氣誘導的支氣管上皮細胞凋亡［8］；miR-34a表達上調(diào)抑制支氣管上皮細胞凋亡［9］；miR-216a-5p通過靶向HMGB1/NF-κB途徑保護支氣管上皮細胞免受氧化應(yīng)激損傷［10］。表明miRNA可能成為減輕支氣管上皮細胞損傷的作用靶點。

miR-98-5p在兒童支氣管哮喘中呈低表達，并可能作為篩查兒童支氣管哮喘的生物標志物［11］。miR-98-5p通過靶向Hmga2減輕糖尿病腎病上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腎纖維化［12］。miR-98-5p通過抑制Bach1減輕氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的神經(jīng)元損傷［13］。但miR-98-5p與支氣管上皮細胞損傷的相關(guān)研究尚未見報道。本研究顯示，LPS誘導的支氣管上皮細胞中miR-98-5p表達降低，提示miR-98-5p在支氣管上皮細胞損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究顯示，LPS可提高支氣管上皮細胞凋亡率及Cleavedcaspase-3表達，與既往研究結(jié)果相似［14］，提示細胞損傷模型構(gòu)建成功。本研究進一步分析顯示，miR-98-5p過表達可降低細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3 表達。炎癥反應(yīng)加重可引起細胞凋亡，本研究深入分析顯示，LPS可提高炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1α水平，而miR-98-5p過表達可明顯降低TNF-α、IL-6、 IL-1α水平，提示miR-98-5p過表達可能通過抑制炎癥反應(yīng)抑制細胞凋亡，進而減輕細胞損傷。

本研究證實HIF1AN是miR-98-5p的靶基因。下調(diào)HIF1AN表達可減輕心肌缺血損傷發(fā)揮心臟保護作用［15］。miR-1-3p通過與HIF1AN作用增強MC3T3-E1細胞成骨細胞分化［16］。miR-214可能通過靶向HIF1AN減輕心肌缺血再灌注損傷［17］。但HIF1AN在支氣管上皮細胞損傷中的作用機制尚未可知。本研究顯示，LPS可提高支氣管上皮細胞HIF1AN與BNIP3表達，進一步分析顯示HIF1AN過表達可明顯拮抗miR-98-5p過表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡及炎癥的抑制作用。

綜上，miR-98-5p可通過抑制HIF1AN表達抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡及炎癥反應(yīng)，減輕支氣管上皮細胞損傷，為進一步闡釋支氣管上皮細胞損傷的分子機制奠定了基礎(chǔ)。但miR-98-5p是否可通過靶向調(diào)控其他靶基因發(fā)揮作用及其具體作用機制仍需進一步探究。