宋志明 錢孝賢 余舒杰 (河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院,開封 475001)
衰老是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展并最終導(dǎo)致心血管疾病的重要危險因素[1]。而與增齡相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞改變在心血管疾病中具有重要作用,且在動脈粥樣斑塊中可檢測到衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞,提示內(nèi)皮衰老與心血管疾病病理生理過程關(guān)系密切[2]。
硫化氫是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子,在維持心血管系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。體外研究證實硫化氫能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老[3]。本研究擬進(jìn)一步在體內(nèi)探討硫化氫對自然衰老小鼠內(nèi)皮的保護(hù)作用。
1.1 材料 雌性C57BL/6小鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物實驗中心;NaHS購自Sigma-Aldrich;RNA提取Iso Plus試劑購自寶生物工程(大連)有限公司;Revert-Aid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DyNAmo ColorFlash SYBR GREEN qPCR Kit購自美國Thermo公司;引物由美國Life Technologies公司設(shè)計合成;甲醛、戊二醛、氯化鎂、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀為分析純,氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉為優(yōu)級純,購自廣州化學(xué)試劑廠;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)購自碧云天生物技術(shù)研究所;NO檢測試劑盒、分型SOD活性及MDA檢測試劑盒購自南京建成生物公司;ICAM-1 ELISA試劑盒購自BD公司。
1.2 方法
1.2.1 動物分組及處理 24只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:對照組(control,3月齡,8只,每天腹腔注射無菌PBS)、模型組(model,22月齡,8只,每天腹腔注射無菌PBS)、實驗組(experimental,22月齡,8只,每天腹腔注射50 μmol/kg NaHS),腹腔注射時乙醇棉球消毒注射區(qū)域皮膚,持續(xù)6周。
1.2.2 標(biāo)本采集 小鼠處理6周后繼續(xù)飼養(yǎng)3 d,處死并收取標(biāo)本。共有5只老年小鼠在標(biāo)本采集前死亡,其中模型組死亡3只,實驗組死亡2只。所有小鼠給予10%水合氯醛(600 mg/kg)進(jìn)行麻醉,參考文獻(xiàn)[4]收集血清,剝離小鼠主動脈血管,保存。
1.2.3 qRT-PCR 實驗操作參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。引物序列為PAI-1 F:5'-TTCAGCCCTTGCTTGCCTC-3',R:5'-ACACTTTTACTCCGAAGTCGGT-3';ICAM-1 F:5'-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3',R:5'-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3';eNOS F:5'-GGCTGGGTTTAGGGCTGTG-3',R:5'-CTGAGGGTGTCGTAGGTGATG-3';β-actin F:5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3',R:5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。
1.2.4 ELISA ELISA檢測各組小鼠血清ICAM-1含量,操作均嚴(yán)格參考試劑說明書進(jìn)行。
1.2.5 血清SOD及MDA測定 黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性,硫代巴比妥比色法(TBA)測定MDA水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
1.2.6 NO含量測定 采用試劑盒測定小鼠血清NO含量,操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
1.2.7 衰老染色
1.2.7.1 染色工作液配制 將X-gal溶于二甲基亞酰,配制成20 mg/ml儲存液。配制40 mmol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉(pH=6.0)、150 mmol/L氯化鈉、 2 mmol/L氯化鎂、5 mmol/L鐵氰化鉀、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、1 mg/ml X-gal。
1.2.7.2 切片 將剝離的血管迅速保存于液氮,包埋于OCT液,-80 ℃固定,采用Leica CM1850進(jìn)行切片(4 μm),收取于防脫玻片。
1.2.7.3 染色 預(yù)冷2%甲醛/0.2%戊二醛室溫固定5 min,棄固定液,每個切片加入1 ml預(yù)冷PBS,搖床緩慢清洗3 min,共3次,加入新鮮配制的染色工作液,1 ml/片,37 ℃、無CO2條件下遮光孵育過夜, 倒置顯微鏡下觀察(×10),拍照,藍(lán)色部分即為衰老組織。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,定量資料用±s表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間兩兩比較,若方差齊,采用LSD檢驗;若方差不齊,采用K-W檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 小鼠體質(zhì)量比較 NaHS干預(yù)前,3組小鼠體質(zhì)量未見明顯差異。處理結(jié)束后,對照組和實驗組小鼠與處理前無明顯差異,而模型組小鼠體質(zhì)量較處理前顯著降低(P<0.01),同時,實驗組小鼠體質(zhì)量較模型組明顯增加(P<0.05,圖1)。
圖1 NaHS對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of NaHS on body weight of mice
2.2 小鼠主動脈內(nèi)皮衰老情況 qRT-PCR結(jié)果顯示,模型組PAI-1 mRNA水平明顯高于對照組,實驗組PAI-1 mRNA水平低于模型組(P<0.05,圖2A)。主動脈內(nèi)皮衰老染色結(jié)果顯示,模型組內(nèi)皮衰老程度較對照組明顯加重,而實驗組內(nèi)皮衰老程度則較模型組顯著減輕(P<0.05,圖2B)。
圖2 NaHS對小鼠主動脈內(nèi)皮衰老的影響Fig.2 Effect of NaHS on aortic senescence in mice
2.3 小鼠主動脈組織ICAM-1 mRNA表達(dá)及血清ICAM-1含量比較 qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組主動脈血管ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯升高,而實驗組ICAM-1 mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05,圖3)。ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠血清ICAM-1含量明顯升高,而實驗組能一定程度減少ICAM-1含量(P<0.05,圖3)。
圖3 NaHS對小鼠主動脈組織ICAM-1 mRNA及血清ICAM-1的影響Fig.3 Effect of NaHS on aortic ICAM-1 mRNA and serum ICAM-1 in mice
2.4 小鼠血清SOD1及MDA含量比較 與對照組相比,模型組小鼠血清SOD1活性較對照組減弱,MDA含量升高。與模型組相比,實驗組小鼠體內(nèi)SOD1活性升高,MDA含量減少(P<0.05,圖4)。
圖4 NaHS對小鼠血清SOD1活性及MDA含量的影響Fig.4 Effect of NaHS on serum SOD1 activity and MDA concentration in mice
2.5 小鼠主動脈組織eNOS mRNA表達(dá)及血清NO含量比較 與對照組相比,模型組小鼠主動脈血管eNOS mRNA表達(dá)減少,血清NO含量降低,而實驗組eNOS mRNA合成增加,血清NO含量提高(P<0.05,圖5)。
圖5 NaHS對主動脈組織eNOS mRNA及血清NO含量的影響Fig.5 Effects of NaHS on aortic eNOS mRNA and serum NO concentration
研究證實,主動脈內(nèi)皮衰老相關(guān)機(jī)制包括NO濃度降低、促炎細(xì)胞因子刺激及氧化應(yīng)激損傷等[5]。雖然血管內(nèi)皮衰老機(jī)制已有一定研究,但目前仍未發(fā)現(xiàn)有效治療方法。
硫化氫是人體內(nèi)源性氣體分子,在心血管系統(tǒng)中主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-r-lyase, CSE)催化產(chǎn)生。硫化氫在體外實驗中被證實具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用[6]。本課題組既往研究已證實硫化氫分別通過調(diào)節(jié)Sirt1/eNOS和Akt活性,增加NO合成改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老[3,7]。硫化氫的生物學(xué)作用存在雙向量效關(guān)系,即高劑量有害,低劑量發(fā)揮保護(hù)作用。正常哺乳動物組織和血漿中硫化氫濃度可達(dá)到1~160 μmol/L,且僅有1/3以氣體形式存在,而NaHS是常用的硫化氫供體[8]。既往研究中,硫氫化鈉腹腔注射小鼠的最常用劑量為 50 μmol/kg[9-10]。結(jié)合既往研究及本研究預(yù)實驗, 50 μmol/kg NaHS屬于小鼠生理范圍劑量,因此選用該劑量進(jìn)行實驗。
主動脈內(nèi)皮組織PAI-1表達(dá)及SA-β-Gal染色是論證血管衰老程度的重要指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn),衰老小鼠主動脈組織PAI-1 mRNA表達(dá)和SA-β-Gal染色陽性率均較年輕對照小鼠明顯升高,而NaHS干預(yù)能夠一定程度改善上述指標(biāo),證實NaHS能夠改善老年小鼠血管衰老。
老年人群體內(nèi)存在持續(xù)低水平的炎癥反應(yīng),炎癥標(biāo)志物如IL-1、ICAM-1和MCP-1也隨著年齡增長而不斷增加[12]。本研究同樣證實老年小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)較年輕小鼠明顯升高。增齡相關(guān)炎癥反應(yīng)增加與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能下降及體內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變密切相關(guān)。
生理條件下,體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡。但隨著年齡增長,氧化損傷逐漸加重[13]。老齡化動物和人群中,氧自由基和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA均明顯增加,同時抗氧化系統(tǒng)SOD等酶活性隨著年齡增長而減弱[14]。本研究提示老年小鼠體內(nèi)SOD1活性減弱,MDA含量增加。
NO廣泛存在于心血管系統(tǒng),具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能的作用,其產(chǎn)生主要受eNOS調(diào)控[15]。衰老內(nèi)皮組織(細(xì)胞)表型變化中兩者均明顯降低,通過兩者檢測既能顯示內(nèi)皮功能情況,又能間接證實內(nèi)皮組織(細(xì)胞)衰老狀態(tài)[11]。與年輕人相比,老年人體內(nèi)eNOS活性明顯減弱[16]。體外細(xì)胞衰老模型中,eNOS活性降低,NO合成減少[3]。本研究中,老年小鼠主動脈組織eNOS mRNA水平及血清NO含量均較年輕小鼠明顯降低,與既往報道一致。
老年人體重呈下降趨勢,可能與肌少癥相關(guān)[17]。線粒體突變等誘導(dǎo)的小鼠衰老模型中,體質(zhì)量減輕是主要衰老相關(guān)表型之一[18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)老年小鼠經(jīng)過6周飼養(yǎng),體質(zhì)量下降具有統(tǒng)計學(xué)意義。
綜上,本研究證實硫化氫能夠降低老年小鼠體內(nèi)炎癥水平,減輕氧化應(yīng)激,增加NO合成,改善衰老小鼠體質(zhì)量減輕,進(jìn)而發(fā)揮主動脈內(nèi)皮保護(hù)作用。