免疫細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制研究①

謝雯雯 林玉平 何志凌 范冠杰（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，廣州 510000）

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的最主要并發(fā)癥之一，是DM患者死亡和致殘的主要原因，尤其是在2型DM患者中。約有三分之二的DM患者的死亡是由心血管疾病引起的，主動(dòng)脈損傷是DM患者死亡的主要并發(fā)癥之一［1］。研究顯示炎癥損傷、氧化應(yīng)激損傷和凋亡是引起主動(dòng)脈增厚和粥樣硬化的主要機(jī)制［2］。近年來研究顯示免疫在動(dòng)脈損傷中也起到關(guān)鍵作用，T輔助細(xì)胞17（T help 17 cells，Th17）的升高和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）水平的降低會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈損傷引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)DM本身會(huì)引起Th17/Treg失調(diào)，并促進(jìn)組織的炎癥損傷［4］。但是免疫細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)在DM大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚。綜上，本文主要分析DM引起的Th17/Treg失調(diào)對(duì)DM大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，12周齡，110～130 g）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美國）；甘精胰島素注射液（J20140052，賽諾菲）；生化試劑盒、HE染色試劑盒以及ELISA試劑盒（碧云天公司，中國）；RNAspin Mini（GE Healthcare，美國）；Bestar qPCR RT和BestarRTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）；抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀釋，#ab6721）（Abcam公司，美國）；硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物無創(chuàng)血壓儀（泰盟公司中國）；彩色超聲多普勒（飛利浦公司，日本）；酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、建模和干預(yù)方法 30只大鼠構(gòu)建DM模型［5］，將STZ溶解于檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.5）中，大鼠一次性腹腔注射STZ，劑量60 mg/kg，對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射后72 h時(shí)用生化試劑盒測(cè)量血糖，72 h時(shí)尾靜脈空腹血糖水平高于16.7 mmol/L提示DM模型建立成功。本次研究建模成功率為83.33%（25/30）。隨機(jī)選取24只建模成功大鼠分為DM組和治療組（n=12）。另外取注射等量檸檬酸鹽緩沖液的大鼠12只作為對(duì)照組。其中治療組接受甘精胰島素注射液皮下注射［6］，4 U/kg，每日1次。8周后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.2.2.1 空腹血糖 分別在建模前、建模后和干預(yù)后收集尾靜脈血，并按照生化試劑盒說明書操作測(cè)量血糖。

1.2.2.2 HE染色 大鼠斷頭處死，收集主動(dòng)脈組織并置入多聚甲醛固定48 h。將固定好的組織樣本利用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水，然后加入二甲苯進(jìn)行透明處理并包埋至石蠟中，使用切片機(jī)切成4 μm厚的切片。切片水化后制成玻片標(biāo)本，加入蘇木精孵育5 min，然后加入0.5%的伊紅染色5 min，洗滌后透化，固定，在顯微鏡下觀察，利用Image-propius 6.0測(cè)量主動(dòng)脈中層厚度。

1.2.2.3 ELISA 取大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮組織勻漿，300 r/min離心15 min收集上清液，分別加入抗體和顯色劑，終止反應(yīng)后15 min內(nèi)檢測(cè)吸光度（450 nm），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位質(zhì)量組織中IL-6和TNF-α的水平（pg/mg）。

1.2.2.4 RT-qPCR 采用RNeasy Mini試劑盒取主動(dòng)脈內(nèi)皮組織中的總RNA，然后采用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37 ℃ 15 min；98 ℃ 5min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算凋亡基因Bcl-2和Caspase3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2.5 Western blot 將主動(dòng)脈內(nèi)皮組織裂解后收集總蛋白。通過8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶完全浸沒硝酸纖維素膜來封閉非特異性抗原（室溫下2 h），隨后將膜分別與一抗（1∶800稀釋）在4 ℃下孵育過夜，然后將山羊抗IgG二抗按照1∶2 000的比例稀釋并在室溫下孵育1 h進(jìn)行反應(yīng)。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，采用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2和Caspase3相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.2.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 將外周血通過密度梯度離心后抽吸淋巴細(xì)胞層，獲得單個(gè)淋巴細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞用20 μl預(yù)冷的1×BD Mouse Foxp3緩沖液在暗室、4 ℃條件下固定30 min，然后洗滌固定劑并收集細(xì)胞。細(xì)胞中加入200 μl通透緩沖液，并將細(xì)胞在37 ℃下避光孵育30 min。洗滌后將細(xì)胞與20 μl小鼠Treg/Th17表型抗體試劑或?qū)φ湛贵w在室溫下孵育30 min。對(duì)于Th17細(xì)胞的檢測(cè)，分別加入5 μl的FITC標(biāo)記的CD4和PE標(biāo)記的IL-17，并在室溫下孵育30 min；對(duì)于Treg，分別加入5 μl的FITC標(biāo)記的CD25和PE標(biāo)記的Foxp3，然后將抗體洗掉，將細(xì)胞重懸并通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析Th17和Treg的百分比。對(duì)于Treg細(xì)胞，兩個(gè)熒光門分別設(shè)為CD25和Foxp3，其中CD25+Foxp3+為Treg細(xì)胞；對(duì)于Th17細(xì)胞，兩個(gè)熒光門分別設(shè)為CD4和IL-17，其中CD4+IL-17+為Th17細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件。組間差異比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩分析使用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組空腹血糖水平比較 建模前各組大鼠血糖正常且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。建模后DM組和治療組大鼠空腹血糖均高于16.7 mmol/L。干預(yù)后，治療組的空腹血糖水平降低至正常值，顯著低于DM組且與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且均顯著高于DM組（P＜0.05），見表1。

表1 各組FBG水平比較（±s，mmol/L）Tab.1 Comparison of fasting blood glucose levels of various groups （±s，mmol/L）

表1 各組FBG水平比較（±s，mmol/L）Tab.1 Comparison of fasting blood glucose levels of various groups （±s，mmol/L）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with DM group， 2）P＜0.05.

After intervention 5.89±1.34 21.52±3.641）62.45±2.512）Groups Control DM Treatment n 12 12 12 Before modeling 5.83±1.29 5.61±1.35 5.84±1.32 After modeling 5.76±1.50 21.97±2.581）22.17±2.632）

2.2 DM對(duì)主動(dòng)脈組織病變和厚度的影響 對(duì)照組主動(dòng)脈HE染色結(jié)果顯示動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜平滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常且排解緊密，動(dòng)脈壁厚度為（45.92±2.05）μm。DM組的主動(dòng)脈血管壁明顯增厚，細(xì)胞膨大、排列紊亂，動(dòng)脈壁厚度為（54.47±2.61）μm，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。治療組血管結(jié)構(gòu)基本清晰，細(xì)胞形態(tài)和排列基本正常，動(dòng)脈壁厚 度 為（46.82±2.72）μm，顯 著 低 于DM組（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 DM對(duì)動(dòng)脈壁厚度的影響（±s，μm）Tab.2 Effect of DM on arterial wall thickness （±s，μm）

表2 DM對(duì)動(dòng)脈壁厚度的影響（±s，μm）Tab.2 Effect of DM on arterial wall thickness （±s，μm）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；compared with DM group， 2）P＜0.05.

圖1 HE染色檢測(cè)DM對(duì)主動(dòng)脈組織病變（×200）Fig.1 HE staining detection of DM on aortic tissue lesions（×200）

2.3 DM對(duì)主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞因子水平的影響 三組大鼠主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞因子水平比較差異顯著（P＜0.05）。DM組的IL-6和TNF-α水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），治療組的IL-6和TNF-α水平顯著低于DM組（P＜0.05），見表3。

表3 DM對(duì)主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞因子水平的影響（±s，pg/mg）Tab.3 Effect of DM on level of inflammatory cytokines in aortic tissue （±s，pg/mg）

表3 DM對(duì)主動(dòng)脈組織中炎癥細(xì)胞因子水平的影響（±s，pg/mg）Tab.3 Effect of DM on level of inflammatory cytokines in aortic tissue （±s，pg/mg）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with DM group， 2）P＜0.05.

2.4 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 通過檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)皮組織中凋亡相關(guān)基因Caspase3和Bcl-2轉(zhuǎn)錄的水平評(píng)估DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示三組大鼠Caspase3 mRNA和Bcl-2 mRNA的水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DM組的Caspase3 mRNA水平顯著高于對(duì)照組，而Bcl-2 mRNA顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。治療組的Caspase3 mRNA水平顯著低于DM組，而Bcl-2 mRNA顯著高于DM組（P＜0.05），見表4。

表4 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase3 mRNA和Bcl-2 mRNA水平的影響（±s） Tab.4 Effect of DM on levels of Caspase3 mRNA and Bcl-2 mRNA in aortic endothelial cells（±s）

表4 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase3 mRNA和Bcl-2 mRNA水平的影響（±s） Tab.4 Effect of DM on levels of Caspase3 mRNA and Bcl-2 mRNA in aortic endothelial cells（±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with DM group， 2）P＜0.05.

2.5 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 通過檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)皮組織中凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bcl-2的水平評(píng)估DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示三組大鼠Caspase3和Bcl-2蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DM組的Caspase3蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而Bcl-2蛋白顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。治療組的Caspase3蛋白表達(dá)量顯著低于DM組，而Bcl-2蛋白顯著高于DM組（P＜0.05），見圖2、表5。

表5 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（±s） Tab.5 Effect of DM on aortic endothelial cell apoptosis（±s）

表5 DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（±s） Tab.5 Effect of DM on aortic endothelial cell apoptosis（±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with DM group， 2）P＜0.05.

圖2 Western blot檢測(cè)DM對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白Caspase3和Bcl-2表達(dá)量的影響Fig.2 Western blot detection of effect of DM on expression of apoptosis marker proteins Caspase3 and Bcl-2 in aortic endothelial cells

2.6 DM對(duì)Th17/Treg平衡的影響 三組大鼠外周血中Th17、Treg、Th17/Treg水平比較差異顯著（P＜0.05）。DM組的Th17水平和Th17/Treg比例顯著高于對(duì)照組，Treg水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。治療組的Th17水平和Th17/Treg比例顯著低于DM組，Treg水平顯著高于DM組（P＜0.05）。見圖3、圖4和表6。

表6 DM對(duì)Th17/Treg平衡的影響（±s） Tab.6 Influence of DM on Th17/Treg balance（±s）

表6 DM對(duì)Th17/Treg平衡的影響（±s） Tab.6 Influence of DM on Th17/Treg balance（±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with DM group， 2）P＜0.05.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DM對(duì)大鼠外周血中Th17水平的影響Fig.3 Flow cytometry to detect effect of DM on level of Th17 in peripheral blood of rats

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DM對(duì)大鼠外周血中Treg水平的影響Fig.4 Flow cytometry to detect effect of DM on level of Treg in peripheral blood of rats

3 討論

全球有3.82億人患有DM，并且這一數(shù)字在2035年將達(dá)到5.92億。DM是心血管意外的主要危險(xiǎn)因素，DM血管并發(fā)癥，包括大血管病變、微血管病變和周圍血管并發(fā)癥，是1型和2型DM中最常見的并發(fā)癥。DM大血管病變導(dǎo)致心肌梗死、中風(fēng)和肢體截肢的風(fēng)險(xiǎn)增加。所有DM患者中約80%死于心血管事件，其中，75%是由于冠心病所致［7］。有效地保護(hù)DM患者主動(dòng)脈及內(nèi)皮功能對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義。

現(xiàn)階段，多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與DM相關(guān)心血管疾病的發(fā)展。與沒有DM的人相比，2型DM的患者的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)擔(dān)更大，動(dòng)脈硬化情況更顯著，冠狀動(dòng)脈腔直徑更小［8］。本次研究聚焦于主動(dòng)脈血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并主要探究炎癥因子的變化。結(jié)果顯示8周持續(xù)的DM會(huì)引起大鼠的主動(dòng)脈壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6和TNF-α的水平升高，凋亡執(zhí)行蛋白Caspase3的表達(dá)量升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低。而使用胰島素進(jìn)行治療后，動(dòng)脈病變情況顯著緩解，內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡情況也得到了有效抑制。DM患者外周血中IL-6和TNF-α水平顯著升高，并且他們參與DM引起的動(dòng)脈損傷［9-10］。TNF-α是外周胰島素抵抗的關(guān)鍵分子，其與IL-6的顯著增加是DM患者葡萄糖代謝異常和細(xì)胞損傷的關(guān)鍵［11］。抑制IL-6等炎癥因子的水平會(huì)緩解DM引起的動(dòng)脈粥樣硬化［12］。而凋亡也是DM引起的動(dòng)脈病變的主要原因，從DM患者動(dòng)脈分離出的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著升高［13］。研究表明DM引起的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［14］。結(jié)合本次研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DM會(huì)提高主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)，并且引起內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而使用胰島素來調(diào)控葡萄糖代謝控制血糖能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡。

組織的炎癥反應(yīng)與機(jī)體的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，外周血中的T細(xì)胞會(huì)與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用甚至浸潤(rùn)進(jìn)入血管內(nèi)皮組織中來調(diào)控炎癥反應(yīng)。研究顯示了DM患者外周血中Th17細(xì)胞比例以及其細(xì)胞因子IL-17的水平升高，它們不但可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等活化誘發(fā)炎癥反應(yīng)，還可以拮抗Treg的作用［15］。Treg會(huì)表達(dá)IL-4等抗炎因子，可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞激活以及免疫炎癥反應(yīng)減少炎癥損傷［16］。本次研究結(jié)果顯示DM大鼠Th17/Treg平衡向Th17偏移，并且胰島素干預(yù)后Th17降低而Treg升高，Th17/Treg失衡恢復(fù)。臨床研究發(fā)現(xiàn)在1型DM患者中，Treg細(xì)胞減少而Th17升高，Th17等促炎型單核細(xì)胞的升高會(huì)引起動(dòng)脈內(nèi)細(xì)胞的炎癥損傷［17］。LI等［18］的研究結(jié)果也顯示在合并動(dòng)脈粥樣硬化的DM小鼠模型中，Th17/Treg比例升高，并導(dǎo)致動(dòng)脈中浸潤(rùn)的M1型巨噬細(xì)胞升高，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的釋放引起動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。這提示DM引起Th17升高和Treg降低，從而導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷和凋亡，而使用胰島素緩解DM后，改善了Th17/Treg的失衡，進(jìn)而緩解內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷和凋亡。

綜上所述，Th17/Treg免疫細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與了DM引起的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但是關(guān)于Th17/Treg的變化機(jī)制仍需要深入研究。