硫化氫供體型去氫樅酸衍生物的合成及其細胞毒性

蔡隆強, 梁莉華, 朱明君, 吳亞菊, 孫金川, 賓冬琪, 李芳耀

(桂林醫(yī)學院 藥學院,廣西 桂林 541199)

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康與生命[1],已成為全球第二大死因,而藥物治療是腫瘤治療的重要手段之一。盡管已有超過數(shù)十種抗腫瘤藥物用于臨床,但大部分化療藥物缺乏選擇性,毒副作用大,很多靶向抗腫瘤藥物容易產(chǎn)生耐藥效應。因此,開發(fā)新型的具有更好療效和安全性的抗腫瘤藥物以及療法是藥物化學家面臨的重大挑戰(zhàn)。

天然產(chǎn)物具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和多效性,是新型抗腫瘤候選藥物和先導化合物的主要來源[2]。去氫樅酸(DHA)是一種含有羧基、菲環(huán)骨架的天然三環(huán)二萜類樹脂酸,與許多活性天然化合物有著相似或相近的結(jié)構(gòu)骨架,并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。據(jù)最近報道,去氫樅酸衍生物具有廣泛的生物和藥理活性,具有抗炎[3]、抗菌[4]、抗原蟲[5]、抗?jié)僛6]、抗病毒[7]、抗真菌[8]、抗衰老[9]和胃保護[10]等活性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，眾多去氫樅酸衍生物對宮頸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞和乳腺癌細胞均有較強抑制作用,并通過多種途徑誘導細胞凋亡[11-14]。

硫化氫(H2S)是內(nèi)源性氣體信號分子,在心血管、神經(jīng)、炎癥反應、呼吸、消化、血液新陳代謝、炎癥和腫瘤生長調(diào)節(jié)等多系統(tǒng)或疾病過程中具有重要的病理生理作用[15]。硫化氫供體型化合物可以實現(xiàn)H2S固體化,近年來該類藥物在臨床的應用也取得了重要進展。朱翠琳等[16]合成了新型線粒體靶向性硫化氫供體AP39,該化合物可以抑制線粒體空泡及線粒體自噬體,改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。李勐等[17]基于非甾體抗炎藥(NSAIDS),引入4-羥基硫代苯甲酰胺,得到一類NSAIDS的H2S供體分子,該類化合物不僅保留了NSAIDS的優(yōu)良抗炎活性,還可以有效減輕NSAIDS的胃腸道不良反應,調(diào)節(jié)平均動脈壓,改善心血管毒副作用。硫化氫供體型化合物在抗腫瘤方面也表現(xiàn)出了一定的治療潛力[18]。有研究顯示,4-羥基硫代苯甲酰胺是一類可釋放H2S的抗腫瘤活性基團,抗炎藥萘普生與H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺拼合形成的ATB-346對人黑色素瘤細胞有抑制增殖作用[19]。

課題組前期對去氫樅酸開展了系列研究工作[20-24],并發(fā)現(xiàn)了若干抗腫瘤活性化合物。因此,本文在前期研究基礎(chǔ)上利用拼合原理將去氫樅酸通過不同碳鏈與H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺偶聯(lián)獲得一系列類似前藥性質(zhì)的“雜合體”,其合成路線如圖1所示。目標化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-MS表征。以阿霉素(DOX)為陽性對照藥,采用MTT法測定目標化合物對人肝癌細胞(HepG2)、人胃癌細胞(MGC803)、人膀胱癌細胞(T24)、人肺癌細胞(A549)和人正常肝細胞(LO2) 5種細胞株的體外細胞毒性,旨在發(fā)現(xiàn)新型具有抗腫瘤活性的去氫樅酸衍生物,為我國優(yōu)勢可再生的林化資源松香的高值化利用開辟新途徑。

圖1 硫化氫供體型去氫樅酸衍生物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRX-4型熔點儀(上海易測儀器設備有限公司);AVANCE AV 400 MHz型核磁共振儀(Bruker公司,CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標);ESQUIREHCT型質(zhì)譜儀(Bruker公司);Prestige-21 FT IR型傅里葉變換紅外光譜儀(Simadzu公司,KBr壓片);OLYMPUS BX51型熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);ELX酶標儀(Bio-Tek公司)。

歧化松香(AR)購自廣西梧州松脂股份有限公司;1,2-二溴乙烷(AR)、 1,3-二溴丙烷(AR)、 1,5-二溴戊烷(AR)和1,6-二溴己烷(AR)購自薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司;4-羥基硫代苯甲酰胺(AR)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余試劑均為分析純。HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2均由桂林醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 去氫樅酸-4-氨基硫代甲?；锦?2)的合成

將去氫樅酸(0.50 g, 16.00 mmol),4-羥基硫代苯甲酰胺(0.17 g, 11.00 mmol),二環(huán)己基碳亞二亞胺(DCC)(0.22 g, 11.00 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(26.00 mg, 0.22 mmol)溶于20 mL無水二氯甲烷中,室溫下攪拌24 h, TLC監(jiān)測反應(石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V)。反應結(jié)束后,加入乙酸乙酯和蒸餾水萃取,有機層用無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析純化得0.39 g白色固體2。

化合物2:淡黃色粉末0.25 g,產(chǎn)率53.60%, m.p.175.0～176.7 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.92～7.88(m, 2H), 7.60(s, 1H), 7.20(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.09～7.05(m, 2H), 7.02(dd,J=8.2 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 2.99～2.92(m, 2H), 2.83(dt,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.43(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.39～2.33(m, 1H), 1.99(d,J=4.6 Hz, 1H), 1.86(m, 5H), 1.65～1.61(m, 2H), 1.40(s, 3H), 1.27(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.22(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 201.66(C=S), 176.80(C=O), 154.23, 146.63, 145.93, 136.54, 134.46, 128.39(2C, C3′、 C5′), 126.95, 124.22, 124.10, 121.54(2C, C2′、 C6′), 48.13, 44.89, 37.94, 37.01, 36.44, 33.48, 25.14, 23.97(2C, C16、 C17), 21.97, 18.55, 16.60; HR-MSm/z: calcd for C27H34NO2S{[M+H]+}436.2310 found 436.2307。

1.3 中間體去氫樅酸溴代酯(3)的合成

化合物3參考文獻[22]合成,將二溴烷烴(18.00 mmol)、去氫樅酸(1.50 g, 5.00 mmol)和無水碳酸鉀(1.30 g, 10.00 mmol)溶于20 mL DMF中,加熱至40 ℃,攪拌反應4 h, TLC監(jiān)測反應(石油醚 ∶乙酸乙酯=2 ∶1,V∶V)。反應結(jié)束后,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,合并有機層后,用飽和食鹽水洗滌2次,在有機層中加入適量的無水硫酸鈉干燥過夜,過濾,減壓蒸除溶劑,粗產(chǎn)物通過硅膠柱梯度層析得化合物3。

1.4 化合物(4)的合成

將化合物3(1.00 mmol)、無水碳酸鉀(0.20 g, 1.50 mmol)和4-羥基硫代苯甲酰胺(0.15 g, 1.00 mmol),溶于10 mL DMF中, 60 ℃攪拌反應10 h, TLC監(jiān)測反應(石油醚 ∶乙酸乙酯=3 ∶1,V∶V)。反應結(jié)束后用二氯甲烷萃取(3×25 mL),有機層用飽和食鹽水洗滌(2×30 mL),加入適量的無水硫酸鈉干燥過夜,過濾,減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析得目標化合物4。

去氫樅酸-2′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?乙酯(4a):黃色粉末0.28 g,產(chǎn)率61.00%, m.p.88.3～90.1 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.88～7.80(m, 2H), 7.54(s, 1H), 7.15(d,J=8.2 Hz, 1H), 7.06(s, 1H), 7.00(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90～6.86(m, 2H), 6.86(s, 1H), 4.52～4.35(m, 2H), 4.21(t, 2H), 2.87～2.77(m, 3H), 2.28(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.24(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 1.82(d,J=6.8 Hz, 1H), 1.74～1.61(m, 4H), 1.47～1.37(m, 2H), 1.27(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.21(s, 3H), 1.19(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.27(C=S), 178.50(C=O), 161.89, 146.86, 145.83, 134.69, 131.68, 129.10(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.24, 123.95, 114.18(2C, C2′、 C6′), 66.13, 62.65, 47.77, 44.75, 37.95, 36.95, 36.52, 33.47, 30.10, 25.16, 24.00(2C, C16、 C17), 21.77, 18.56, 16.51; HR-MSm/z: calcd for C29H38NO3S{[M+H]+}480.2572 found 480.2570。

去氫樅酸-3′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?丙酯(4b):黃色粉末0.21 g,產(chǎn)率43.80%, m.p.91.5～93.2 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.95～7.87(m, 2H), 7.71(s, 1H), 7.24(s, 1H), 7.19(d,J=8.2 Hz,1H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.92～6.86(m, 3H), 4.35～4.22(m, 2H), 4.11～4.08(m, 2H), 2.91～2.85(m, 2H), 2.85～2.82(m, 1H), 2.33(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.26(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.15(m, 2H), 1.89～1.82(m, 1H), 1.79～1.65(m, 4H), 1.54～1.48(m, 1H), 1.43～1.39(m, 1H), 1.30(s, 3H), 1.26(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.23(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.25(C=S), 178.58(C=O), 162.16, 146.86, 145.82, 134.58, 131.36, 129.15(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.20, 124.00, 114.06(2C, C2′、 C6′), 64.75, 61.25, 47.74, 44.88, 37.97, 36.97, 36.70, 33.47, 30.09, 28.53, 25.21, 24.02(2C, C16、 C17), 21.79, 18.59, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C30H40NO3S{[M+H]+}494.2729 found 494.2727。

去氫樅酸-5′-(4-氨基硫代甲酰基苯氧基)戊酯(4c):淡黃色粉末0.22 g,產(chǎn)率41.60%, m.p.146.7～147.4 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.93～7.88(m, 2H), 7.61(s, 1H), 7.19(m, 2H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90(m, 1H), 6.89～6.86(m, 2H), 4.12(m, 2H), 4.03(t,J=6.3 Hz, 2H), 2.89(dd,J=9.7 Hz, 5.0 Hz, 2H), 2.84(dd,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.33(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.28(dd,J=12.5 Hz, 1.9 Hz, 1H), 1.88(dd,J=10.4 Hz, 7.7 Hz, 1H), 1.86～1.78(m, 4H), 1.73～1.70(m, 2H), 1.66(m, 2H), 1.58～1.54(m, 2H), 1.50(m, 1H,), 1.46～1.43(m, 1H), 1.29(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.24(d,J=2.4 Hz, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.35(C=S), 178.67(C=O), 162.48, 146.93, 145.77, 134.66, 131.08, 129.11(2C, C3′、 C5′), 126.94, 124.24, 123.98, 114.05(2C, C2′、 C6′), 67.94, 64.37, 47.69, 44.82, 37.98, 36.99, 36.67, 33.46, 30.16, 28.68, 28.41, 25.25, 24.00(2C,C16、 C17), 22.58, 21.78, 18.63, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C32H44NO3S{[M+H]+}522.3042 found 522.3037。

去氫樅酸-6′-(4-氨基硫代甲?；窖趸?己酯(4d):黃色粉末0.22 g, 產(chǎn)率40.10%, m.p.103.4～104.5 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.88(d,J=8.1 Hz, 2H,), 7.68(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.17(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.00(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.91～6.78(m, 3H), 4.14～4.01(m, 2H), 3.98(t,J=6.1 Hz, 2H), 2.85～2.71(m, 3H), 2.29(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.24(d,J=12.4 Hz, 1H), 1.88～1.74(m, 5H), 1.65(m, 4H), 1.51～1.38(m, 6H), 1.26(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.20(s, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.33(C=S), 178.69(C=O), 162.54, 146.96, 145.76, 134.66, 131.06, 129.13(2C, C3′、 C5′), 126.93, 124.23, 123.98, 114.06(2C, C2′、 C6′), 68.11, 64.52, 47.68, 44.86, 38.01, 36.99, 36.68, 33.47, 30.16, 28.99, 28.59, 25.77, 25.65, 25.23, 23.99(2C, C16、 C17), 21.77, 18.64, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C33H46NO3S{[M+H]+}536.3198 found 536.3194。

1.5 目標化合物體外細胞毒性測試

以阿霉素為陽性對照藥,采用MTT法測試目標化合物對HepG2、 MGC803、 T24、 A549和LO2的抑制活性。將上述5種細胞培養(yǎng)在10%完全培養(yǎng)基中(DMEM培養(yǎng)基 ∶胎牛血清 ∶雙抗(青鏈霉素)=100 ∶10 ∶1，V∶V∶V),并置于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細胞均勻接種在96孔板中,在96孔板的四周加入相同體積的PBS,培養(yǎng)至細胞貼壁,分別按不同計量濃度加入阿霉素、去氫樅酸和目標化合物,孵育44 h后每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)處理4 h,終止培養(yǎng)。離心后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液,最后每孔加入150 μL的DMSO,震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在490 nm的波長下測定每孔吸光度OD值,計算藥物對細胞的抑制率。實驗重復3次后取平均值,利用SPSS 23.0計算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成條件優(yōu)化

將去氫樅酸和4-羥基硫代苯甲酰胺進行反應時,選擇酯化反應法進行拼接,在兩種催化條件下:(1) 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)/1-羥基苯并三唑(HOBT); (2) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/二甲氨基吡啶(DMAP),去氫樅酸羧基與4-羥基硫代苯甲酰胺羥基化合物完成酯化。后者產(chǎn)率更高,在提純時更容易進行，不僅節(jié)約溶劑且環(huán)保。在合成化合物3時,二溴烷烴需過量3倍,其目的是為了減少雙酯副產(chǎn)物的生成。

2.2 化合物波譜解析

在1H NMR譜圖中,酰胺基團中的伯胺和苯環(huán)上的氫化學位移特征峰出現(xiàn)在δ6.86～8.00,連接酯基和苯氧基的亞甲基上的特征峰出現(xiàn)在δ3.98～4.52。在13C NMR譜圖中,目標化合物C=S中碳峰出現(xiàn)在δ201.00附近,羰基碳的特征峰出現(xiàn)在δ178.00附近,并且目標化合物的質(zhì)荷比(m/z)均與所設計的目標產(chǎn)物的分子量相吻合。由此可見,目標化合物的結(jié)構(gòu)符合預期。

2.3 體外細胞毒性

采用MTT法測試了目標化合物對HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2 5種細胞株的體外細胞毒性,結(jié)果如表1所示?；衔?對A549有一定的抑制活性,IC50值為13.45±0.54 μmol·L-1,但對其它幾種腫瘤細胞活性較弱,這可能為去氫樅酸與硫代苯甲酰胺通過酯鍵連接減弱了硫代苯甲酰胺釋放H2S的能力。因此,本文通過設計不同碳鏈將去氫樅酸與硫代苯甲酰胺偶聯(lián),研究碳鏈的長度對細胞毒性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當去氫樅酸與4-羥基硫代苯甲酰胺的碳鏈長度增長至5個碳時(化合物4c),可明顯增強對HepG2、 T24 和A549 的增殖抑制作用,IC50值分別為4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1;碳鏈長度增長至6個碳時,活性又略微下降。由此可推斷,抗腫瘤活性的提高與延長分子長度變化引起供體釋放H2S能力變化有關(guān),鏈接子以5個C為最佳,具體的作用機制仍有待后續(xù)研究加以確證。

表1 化合物的體外細胞毒性

本文利用前藥原理,合成了5個新型去氫樅酸-4-羥基硫代苯甲酰胺軛合物,細胞毒性結(jié)果表明:化合物4a對A549的IC50值為7.68±0.35 μmol·L-1,化合物4d對HepG2和MGC-803細胞株有較強的抑制活性,IC50值達到微摩爾水平,而活性最為顯著的是化合物4c,化合物4c對HepG2、 T24和A549細胞株的IC50值分別為4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1,優(yōu)于或接近陽性對照藥阿霉素。H2S供體4-羥基硫代苯甲酰胺的引入,可顯著提高母體化合物對腫瘤細胞株的抑制活性。