髕下脂肪墊源間充質干細胞的無酶法獲取及修復兔膝關節(jié)軟骨病損的研究

付奇?zhèn)?李浩博 周義欽 邵加華 陳宜

膝關節(jié)對于人體正?；顒佑兄匾囊饬x，在長期的負重、活動的過程中，膝關節(jié)會不斷發(fā)生輕微的磨損，從而造成膝關節(jié)損傷[1-2]。目前，全球平均每年新增膝關節(jié)損傷患者已超過 60 萬例，相較 10 年前其發(fā)病率已增加了約 5～7 倍[3-4]。其中，軟骨損傷是極為常見的一種，由創(chuàng)傷、老年性退化或特異性疾病引起，約占所有膝關節(jié)損傷中的 30%～ 40%[5]。軟骨損傷通常伴有明確的關節(jié)疼痛，活動時伴有彈響或者出現交鎖、嵌頓等現象，影響膝關節(jié)的屈伸、負重活動，對于人體的正常活動有著顯著的影響[6]。另一方面，由于關節(jié)軟骨結構具有高度分化、無血管、無神經的特點，使得關節(jié)軟骨缺乏自我再生及愈合能力，一旦損傷，即使再小的病損也難以自身修復[7]。目前，臨床中對于軟骨損傷的治療仍以保守治療或者修復手術為主，但均存在較高的局限性，患者間的療效也存在明顯差 異[8-9]，因此臨床上一直致力于尋找到新的軟骨損傷修復方式。

干細胞移植再生技術是醫(yī)學領域的最新科技，它利用干細胞在軟骨環(huán)境下轉化成為成熟的軟骨細胞進而完成軟骨再生，其中，間充質干細胞 ( mesenchymal stem cells，MSCs ) 是最常用的一類[10-11]。 而髕下脂肪墊源間充質干細胞 ( infrapatellar fat pad stem cells，IPFP-MSCs ) 則是由腹部皮下脂肪層與髕下脂肪墊中獲取的一種干細胞，具有優(yōu)秀的增殖、多向分化能力，同時又因其充足的儲備，被認為是 MSCs 最理想的來源[12]。面對目前日益高發(fā)且難以防治的膝關節(jié)軟骨損傷，盡快尋找到一種更有效、快速且穩(wěn)定的治療方式對于患者的正常生活有著重要意義。而 IPFP-MSCs 對于軟骨細胞的修復改善效果可能是未來膝關節(jié)軟骨損傷的治療突破口。因此，本研究通過分離提取 IPFP-MSCs，并分析其對于膝關節(jié)軟骨病損動物模型的軟骨修復效果，為軟骨損傷的臨床治療提供一種新的可靠的指導建議，從而為未來軟骨損傷患者提供更可靠的安全保障。

材料與方法

33.5 kg 的 4 月齡雄性新西蘭大白兔 30 只，購買自上海松聯實驗動物基地，動物生產許可證號：SCXK ( 滬 ) 2017-0008。于華東師范大學實驗動物中心飼養(yǎng)，自由進食、進水。

一、IPFP-MSCs 提取

采用隨機數字表法，隨機挑選 6 只實驗兔，3% 戊巴比妥鈉溶液耳緣靜脈注射 ( 30 mg / kg ) 實驗兔麻醉后，取兔膝前正中切口切開皮膚，經髕旁內側切開關節(jié)囊，并沿髕腱內側向下銳性切開，將髕骨向外側脫位，暴露、分離并切取髕下脂肪墊。取下的髕下脂肪墊組織磷酸鹽緩沖液 ( phosphate buffered saline，PBS ) 漂洗 3 次剪碎，酶消化法則加入 0.1% Ⅰ 型膠原酶充分震蕩混勻 1 h，無酶消化法則加入 5 ml PBS 溶液稀釋。隨后 DMEM 培養(yǎng)基消化并離心棄去上清，獲得髕下脂肪墊的基質血管成分 ( stromal vascular fraction，SVF )。SVF 接種于 DMEM / F12 培養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2環(huán)境中培育 IPFP-MSCs，每 3 天更換 1 次培養(yǎng)基，細胞生長度達 80% 時進行傳代，取第三代 IPFP-MSCs 進行后續(xù)實驗。

IPFP-MSCs 表征觀察使用透射電子顯微鏡觀察 IPFP-MSCs 細胞形態(tài)，記錄無酶法與酶消化法提取的 IPFP-MSCs 形態(tài)差異。

IPFP-MSCs 活性檢測細胞接種于 6 孔板，每孔加入 2 ml DMEM / F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)后 14 天棄去培養(yǎng)基，加入甲醇固定 20 min 后結晶紫染色，對細胞集落形成進行計數。另取上述細胞重懸濃度至 2×103個 / ml，接種于 96 空板中，分別于 12 h、 24 h、48 h、72 h、96 h 取一孔加入 10 μl CCK-8 溶液，并于酶標儀 ( 450 nm ) 下檢測細胞吸光度值，繪制細胞生長曲線。

二、IPFP-MSCs 免疫表型鑒定

PBS 重懸細胞后，選擇單克隆抗體 CD44、CD90、CD45、CD34，進行流式細胞術 ( FC ) 檢測，檢測結果使用 Flowjo 10 軟件處理。

IPFP-MSCs 分化潛能檢測參考 Longoni 等[13]、Zhao 等[14]的研究，進行爬片法與成軟骨小球法實驗。另使用 Trizol 提取細胞總 RNA，驗證純度后按照試劑盒說明書逆轉錄為 cDNA，取 10 μl cDNA 進行擴增反應。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s； 60 ℃ 60 s，共 40 個循環(huán)，以 GAPDH 為內參，2-△△CT-計算 COL2、SOX9、ACAN、COL10 相對表達 ( 表 1 )。

表1 引物序列 Tab.1 Primer sequence

膝關節(jié)軟骨損傷模型建立適應性喂養(yǎng)后 1 周，以兔膝前正中為切口入路逐層切開 ( 3 cm )，經髕骨內側將髕骨向外側脫位，暴露膝關節(jié)。使用直徑 5 mm 的鉆頭在股骨滑車緩慢鉆孔，深度約 1.0～ 1.5 mm，不暴露軟骨下骨 ( 病損區(qū)無滲血 )，然后縫合切口 ( 圖 1 )。

圖1 動物實驗模型手術照片 a：手術切口為兔膝前正中切口；b：軟骨病損造模，股骨滑車鉆孔，直徑 5 mm，深度 1.0～ 1.5 mm，不暴露軟骨下骨，病損區(qū)肉眼觀無滲血Fig.1 Surgeries to establish animal models a: Median incision was chosen for surgery; b: Cartilage lesions made for animal models, with diameter of 5 mm and depth of 1.0 - 1.5 mm without exposing subchondral bone and errhysis

三、動物分組與干預

剩余 24 只實驗兔隨機分為 A、B、C、D 4 組。 A 組關節(jié)腔注射無酶法分離的 IPFP-MSCs ( 0.5 ml )；B 組注射酶消化法分離的 IPFP-MSCs ( 0.5 ml )；C 組注射無酶法分離的 SVF ( 1 ml )；D 組注射生理鹽水 ( 1 ml )。術后 3 天內每天肌注青霉素鈉 ( 5 萬 IU / kg )。

四、動物樣本采集與觀察

分別于干預 6 周、12 周時于麻醉狀態(tài)處死 3 只實驗兔，取得完整膝關節(jié)組織，石蠟包埋，進行蘇木精 - 伊紅 ( HE )、番紅 O ( safranin O )、甲苯胺藍 ( toluidine blue )、天狼星紅 ( sirius red ) 染色。以國際軟骨修復學會 ( ICRS ) 組織學評分評估軟骨修復效果，組織切片評分由 2 位病理科主治醫(yī)師在雙盲的情況下進行評分。

五、統計學處理

結 果

一、IPFP-MSCs 的分離培養(yǎng)

接種后 48 h，無酶法和酶消化法分離的 SVF 均有梭狀細胞貼壁形成，但無酶法生成的貼壁細胞較少 ( 圖 2a、b )。培養(yǎng) 14 天時，兩種方法均觀察到成簇生長的細胞，但無酶法生成的集落同樣少于消化組，顯微鏡下細胞形態(tài)大體一致，形似紡錘，呈長梭狀、簇狀聚集 ( 圖 2c、d )。

二、IPFP-MSCs 活性檢測結果

原代細胞經培養(yǎng)后 14 天，兩種分離方法均有明顯的集落數，而無酶法的集落數少于酶消化法 ( 圖 3a、d )；兩種細胞形態(tài)上大體一致 ( 圖 3b、c、e、f )。而 CCK-8 實驗則顯示，兩種分離方法獲得的 IPFP-MSCs 的細胞生長情況差異無統計學意義 (P＜ 0.05，圖 4 )。

IPFP-MSCs 表型鑒定結果經流式細胞計數分析，可見無酶法和酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中 CD44 表達陽性率分別為 ( 98.89±0.23 ) %、( 98.92±0.25 ) %；CD90 分別為 ( 98.59±0.27 ) %、( 98.54±0.29 ) %； CD45 分別為 ( 0.95±0.07 ) %、( 0.95±0.04 ) %；CD34 分別為 ( 1.41±0.11 ) %、( 1.69±0.09 ) %。 兩種方法的表型標志物比較差異均無統計學意義 (P＞ 0.05，圖 5 )。

圖2 無酶法和酶消化法提取 IPFP-MSCs 鏡下觀察代表圖 a：無酶法分離的 SVF 接種后 3 天的狀態(tài) ( ×200 )；b：酶消化法分離的 SVF 接種后 3 天的狀態(tài) ( ×200 )；c：無酶法分離的 SVF 接種 后 14 天的狀態(tài) ( ×200 )；d：酶消化法分離的 SVF 接種后 14 天的狀態(tài) ( ×200 )。無酶法和酶消化法分離的 SVF 均有梭狀細胞貼壁形成，但無酶法生成的貼壁細胞較少。14 天時，兩種方法均觀察到成簇生長的細胞Fig.2 IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic and enzymatic method observed by optical microscope a: SVF isolated by non-enzymatic method 3 days later; b: SVF isolated by enzymatic method 3 days later; c: SVF isolated by non-enzymatic method 14 days later; d: SVF isolated by enzymatic method 14 days later. Both the SVF isolated by the non-enzymatic method and enzymatic method had spindle cell adherent formation, but fewer adherent cells were generated by the non-enzymatic method. At 14 d, cells growing in clusters were observed for both methods

三、IPFP-MSCs 成軟骨分化檢測

免疫熒光染色結果顯示，兩種細胞均可見 Ⅱ 型膠原陽性表達 ( 細胞基質呈橙紅色 ) ( 圖 6 )。甲苯胺藍、HE 染色后均可見細胞間質染色，提示蛋白多糖沉積，Collagen Ⅱ 免疫組化抗原抗體反應陽性，提示軟骨球內 Ⅱ 型膠原產生，兩者未見明顯異常 ( 圖 7 )。

四、IPFP-MSCs 成軟骨分化檢測

PCR 檢測結果顯示，無酶法和酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中軟骨相關基因 COL2、SOX9、ACAN 的表達，差異均無統計學意義 (P＞ 0.05，圖 8 )。

圖3 IPFP-MSCs 活性檢測結果 a：無酶法分離的 IPFP-MSCs 集落形成 ( 結晶紫染色 )；b：4 倍鏡下觀察無酶法分離的 IPFP-MSCs ( 結晶紫染色×4 )；c：10 倍鏡下觀察無酶法分離的 IPFP-MSCs ( 結晶紫染色×10 )；d：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 集落形成 ( 結晶紫染色 )；e：4 倍鏡下觀察酶消化法分離的 IPFP-MSCs ( 結晶紫染色×4 )；f：10 倍鏡下觀察酶消化法分離的 IPFP-MSCs ( 結晶紫染色×10 )Fig.3 The viability of IPFP-MSCs a: The colonies formed by IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( crystal violet staining ); b: IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method observed by 4 × microscope ( crystal violet staining × 4 ); c: IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method observed by 10 × microscope ( crystal violet staining × 10 ); d: The colonies formed by IPFP-MSCs isolated by enzymatic method ( crystal violet staining ); e: IPFP-MSCs isolated by enzymatic method observed by 4 × microscope ( crystal violet staining × 4); f: IPFP-MSCs isolated by enzymatic method observed by 10 × microscope ( crystal violet staining × 10 )

圖4 無酶法與酶消化法分離的 IPFP-MSCs 細胞生長曲線。兩種分離方法均有明顯的集落數 ( CF：Collagenase-Free；CT：Collagenase-Treated )Fig.4 Growth curve of the IPFP-MSCs isolated by two methods, both isolation methods had significant colony counts ( CF: Collagenasefree; CT: Collagenase-treated )

圖5 IPFP-MSCs 表型鑒定結果 a：無酶法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD44 表達；b：無酶法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD90 表達；c：無酶法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD45 表達；d：無酶法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD34 表達；e：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD44 表達；f：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD90 表達；g：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD45 表達；h：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 中的 CD34 表達。CD44、CD90、CD34、CD45 表達均無差異Fig.5 The surface markers of IPFP-MSCs a: The expression of CD44 in IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method; b: The expression of CD90 in IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method; c: The expression of CD45 in IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method; d: The expression of CD34 in IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method; e: The expression of CD44 in IPFP-MSCs isolated by enzymatic method; f: The expression of CD90 in IPFP-MSCs isolated by enzymatic method; g: The expression of CD45 in IPFP-MSCs isolated by enzymatic method; h: The expression of CD34 in IPFP-MSCs isolated by enzymatic method. There were no differences in the expressions of CD44, CD90, CD34 and CD45

圖6 免疫熒光染色結果 a～c：無酶法分離的 IPFP-MSCs ( 免疫熒光染色×40 )；d～f：酶消化法分離的 IPFP-MSCs ( 免疫熒光染色× 40 )。兩種分離方法均可見 Ⅱ 型膠原陽性表達Fig.6 The results of fluorescence immunoassay a - c: Fluorescence immunoassay of IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( immunofluorescent staining × 40 ); d - f: Fluorescence immunoassay of IPFP-MSCs isolated by enzymatic method ( immunofluorescent staining ×40 ). Positive expression of collagen type Ⅱ was seen with both isolation methods

五、軟骨損傷情況

第 6 周時，可見 A 組軟骨病損區(qū)域內有新生的組織填充，凹陷，不平整，界限清楚 ( 圖 9a )；B 組軟骨病損區(qū)域內有新生的組織填充，凹陷，不平整，界限清楚 ( 圖 9b )；C 組軟骨病損區(qū)有新生組織，新生組織較 A、B 組薄，表面不平整，凹陷界限清楚，內側緣附近軟骨組織有損傷 ( 圖 9c )；D 組病損區(qū)凹陷，界限清楚，未見明顯新生組織形成，周緣的軟骨組織受損 ( 圖 9d )。第 12 周時，A 組軟骨病損區(qū)域內新生的組織填充，表面相對平整，界限模糊 ( 圖 10a )；B 組原軟骨病損區(qū)域內有新生的組織填充，平整，界限模糊 ( 圖 10b )；C 組軟骨病損區(qū)有新生組織較 A、B 組薄，表面不平整，凹陷界限清楚 ( 圖 10c )；D 組病損區(qū)凹陷，界限清楚，周緣疤痕樣新生組織形成 ( 圖 10d )。

圖7 甲苯胺藍、HE 染色結果 a：無酶法分離的 IPFP-MSCs 軟骨小球甲苯胺藍染色切片大體觀 ( 甲苯胺藍×4 )；b：無酶法分離的 IPFP-MSCs 甲苯胺藍染色圖 ( 甲苯胺藍×10 )；c：無酶法分離的 IPFP-MSCs HE 染色圖 ( HE×10 )；d：無酶法分離的 IPFP-MSCs Collagen Ⅱ 免疫化學染色 ( Collagen Ⅱ 染色×10 )；e：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 軟骨小球甲苯胺藍染色切片大體觀 ( 甲苯胺藍×4 )；f：酶消化法分離的 IPFP-MSCs 甲苯胺藍染色圖 ( 甲苯胺藍×10 )；g：酶消化法分離的 IPFP-MSCs HE 染色圖 ( HE×10 )；h：酶消化法分離的 IPFP-MSCs Collagen Ⅱ 免疫化學染色 ( Collagen Ⅱ 染色×10 )。兩種分離方法均可見 Ⅱ 型膠原陽性表達Fig.7 The results of Toluidine blue staining and HE staining a: The general observation of cartilage pellet by Toluidine blue staining from IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( Toluidine blue staing × 4 ); b: Toluidine blue staining of cartilage pellet from IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( Toluidine blue staing × 10 ); c: HE staining of cartilage pellet from IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( HE staining × 10 ); d: Collagen Ⅱ immunohistochemical analysis for cartilage pellet from IPFP-MSCs isolated by non-enzymatic method ( Collagen Ⅱ stain × 10 ); e: The general observation of cartilage pellet by Toluidine blue staining from IPFP-MSCs isolated by enzymatic method ( Toluidine blue staing × 4 ); f: Toluidine blue staining of cartilage pellet from IPFP-MSCs isolated by enzymatic method ( Toluidine blue staing × 10 ); g: HE staining of cartilage pellet from IPFPMSCs isolated by enzymatic method ( HE staining × 10 ); h: Collagen Ⅱ immunohistochemical analysis for cartilage pellet from IPFP-MSCs isolated by enzymatic method ( Collagen Ⅱ stain × 10 ). Positive expression of collagen type II was seen with both isolation methods

圖8 PCR 檢測軟骨相關基因表達 ( CF：Collagenase-Free；CT：Collagenase-Treated )Fig.8 Cartilage related gene expressions by IPFP-MSCs by PCR ( CF: Collagenase-free; CT: Collagenase-treated )

六、軟骨組織學觀察結果

從膝關節(jié)軟骨損傷實驗兔的軟骨組織染色結果可知，第 6 周時，A 組與 B 組中原軟骨病損區(qū)底部均有連續(xù)新生的軟骨層覆蓋，B 組稍厚。C 組則有少量不連續(xù)新生組織，未見明顯軟骨細胞生成。D 組完全未見新生組織形成，軟骨下骨破壞嚴重 ( 圖 11a～d )。第 12 周時，A、B、C 3 組修復效果較 6 周時均有升高。A、B 組病損區(qū)均已覆蓋新生完整組織。C 組病損區(qū)底部有不光整新生軟骨層覆蓋。D 組表面凹凸不平，僅有纖維結締組織增生 ( 圖 12a～d，圖 10 )。

圖10 第 12 周時膝關節(jié)軟骨損傷兔軟骨組織形態(tài) a：A 組軟骨組織形態(tài)；b：B 組軟骨組織形態(tài)；c：C 組軟骨組織形態(tài)；d：D 組軟骨組織形態(tài)Fig.10 Morphology of cartilage tissue in rabbits with knee cartilage injury at 12 weeks a: Morphology of cartilage tissue in group A; b: Morphology of cartilage tissue in group B; c: Morphology of cartilage tissue in group C; d: Morphology of cartilage tissue in group D

圖11 第 6 周時軟骨組織染色結果 a～d：A 組軟骨組織染色結果；e～h：B 組軟骨組織染色結果；i～l：C 組軟骨組織染色結果； m～p：D 組軟骨組織染色結果 [ a、e、i、m 為 HE 染色 ( HE×100 )；b、f、j、n 為番紅固綠染色 ( HE×100 )；c、g、k、o 為甲苯胺藍染色 ( HE×100 )；d、h、l、p 為天狼星紅染色 ( HE×100 )。A、B 組軟骨損傷情況有一定改善，C 組與 D 組軟骨損傷情況嚴重 ]Fig.11 Histological staining results of cartilage tissue 6 weeks after surgery a - d: Histological staining results of cartilage tissue in group A; e - h: Histological staining results of cartilage tissue in group B; i - l: Histological staining results of cartilage tissue in group C; m - p: Histological staining results of cartilage tissue in group D [ a, e, i, m were HE staining ( HE × 100 ); b, f, j, n were Safranin O / Fast Green staining ( HE × 100 ); c, g, k, o were Toluidine blue staining ( HE × 100 ); d, h, l, p were Sirian staining ( HE × 100 ). The cartilage damage in group A and B was improved to a certain extent, and the cartilage damage in group C and D was serious ]

圖12 第 12 周時軟骨組織染色結果 a～d：A 組軟骨組織染色結果；e～h：B 組軟骨組織染色結果；i～l：C 組軟骨組織染色結果； m～p：D 組軟骨組織染色結果 [ a、e、i、m 為 HE 染色 ( HE×100 )；b、f、j、n 為番紅固綠染色 ( HE×100 )；c、g、k、o 為甲苯胺藍染色 ( HE×100 )；d、h、l、p 為天狼星紅染色 ( HE×100 )。A、B、C 組軟骨損傷情況有明顯改善，D 組損傷依然嚴重 ]Fig.12 Histological staining results of cartilage tissue 12 weeks after surgery a - d: Histological staining results of cartilage tissue in group A; e - h: Histological staining results of cartilage tissue in group B; i - l: Histological staining results of cartilage tissue in group C; m - p: Histological staining results of cartilage tissue in group D [ a, e, i, m were HE staining ( HE × 100 ); b, f, j, n were Safranin O / Fast Green staining ( HE × 100 ); c, g, k, o were Toluidine blue staining ( HE × 100 ); d, h, l, p were Sirian staining ( HE × 100 ). The cartilage damage in group A, B, and C was significantly improved, and the damage in group D was still serious ]

討 論

目前，干細胞移植已被譽為臨床再生醫(yī)學的新希望，其修復效果已獲得的一致認可[15-16]。傳統酶消化法提取的脂肪 MSCs 污染的可能性較高，且耗時較長，因此無法實現在臨床中的普及使用[17-18]。本研究通過無酶分離方法從兔髕下脂肪墊中提取 IPFP-MSCs，這對于未來干細胞移植的再生修復治療具有重要的參考意義。

本研究結果顯示，使用無酶法提取的 IPFP-MSCs 與酶消化法提取的 IPFP-MSCs 具有較為一致的形態(tài)特征，流式檢測結果顯示出具有 CD44、CD90 陽性，CD34、CD45 陰性的特征，符合 IFATS 和 ISCT 的定義的脂肪 MSCs 標準[19]。不僅如此，細胞活性的檢測結果也顯示，通過無酶法提取的 IPFP-MSCs 雖然集落形成率要略低于酶消化法提取的 IPFP-MSCs，但其細胞形態(tài)與生長狀態(tài)已無明顯差異。這說明了兩種方法均獲得較為穩(wěn)定的 IPFP-MSCs。此外，軟骨分化潛能的檢測結果也顯示出兩種方法分離的 IPFP-MSCs 無明顯差異，再一次強調了無酶法分離的 IPFP-MSCs 具有重要的臨床應用潛力。通過無酶法獲取的 SVF 細胞群中多含有較多的外周血單核細胞，而祖細胞數量明顯減少[20-23]。這是因為脂肪 MSCs 主要集中在中小型血管結構周圍，無酶消化下許多的干細胞仍在血管內皮層和結締組織碎片中[24-25]。

相比較酶消化法則可完全彌補這一缺陷，但其成本昂貴，每克脂肪組織所需酶的費用即達到 2～ 5 美元[26]。在此成本下，實現臨床的普及應用難度極大。因此，無酶法成為了更具有效益的替代方案。而本研究結果也證實，通過無酶法分離的 IPFP-MSCs 可以達到脂肪 MSCs 的基本要求，且與酶消化法分離的 IPFP-MSCs 形態(tài)、結構未存在較大差異，這可以為未來干細胞移植提供新的方向。

此外，為了確認使用無酶法分離的 IPFP-MSCs 對軟骨損傷的修復效果，本研究還建立了膝關節(jié)軟骨損傷的實驗兔模型，并使用其分離的 IPFP-MSCs 進行干預。而實驗結果顯示，雖然其整體修復效果不如酶消化法分離的 IPFP-MSCs，但實驗兔的軟骨病損區(qū)域內有明顯新生的組織填充，且組織染色結果可較為連續(xù)的新生軟骨層。這說明通過無酶法分離的 IPFP-MSCs 具有對軟骨組織的修復、改善作用。目前，干細胞移植已成為了臨床再生醫(yī)學研究的重點項目，國內外的研究人員已發(fā)現干細胞移植對于如白血病、燒傷、再生性貧血等疾病的治療 中[27-29]，而對于關節(jié)疾病而言，干細胞移植也展現出了優(yōu)秀的效果。如 Walpole 等[30]發(fā)現骨髓瘤患者造血干細胞移植后，病理改變被明顯抑制，而 Liu 等[31]則認為干細胞可以促進骨折的加速愈合。這些結果不僅充分證實了干細胞移植的重要臨床應用潛力，也可以佐證本實驗的結果。但是，干細胞的來源正是目前正亟需解決的關鍵問題。而本次研究中通過無酶法分離的 IPFP-MSCs 不僅具有干細胞的特點，也在軟骨損傷的治療中展現出了優(yōu)秀的效果，這極有可能成為未來干細胞移植治療的突破口。

針對再生醫(yī)學治療的干預應該是針對患者疾病程度、個體差異而采取的個性化醫(yī)療，雖然目前對軟骨病損的干細胞移植修復已取得了一定的進展，但距離實際的臨床應用還缺少更可靠的論證。未來，同樣需要針對無酶法分離的 IPFP-MSCs 展開更深入的分析，獲得更多的科研成果，為臨床再生醫(yī)學的轉化應用提供有力的證據。

綜上所述，通過無酶法分離提取的 IPFP-MSCs 具有典型的脂肪間充質干細胞形態(tài)特征，與酶消化法相比更具經濟效應；且對于膝關節(jié)軟骨損傷兔的軟骨組織有著優(yōu)秀的改善效果，有望成為未來臨床治療膝關節(jié)軟骨損傷的新方案。