卵母細(xì)胞分泌因子在卵巢儲備功能減退患者中的表達(dá)及對胚胎發(fā)育的影響

程立立，劉少華，劉 珊，許鵬宇，李冬秀，劉松娜，齊麗麗

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,河北石家莊 050000；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 河北邢臺 054000；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,河北石家莊 050000

目前，晚婚晚育已成為社會常態(tài)，特別是我國生育政策放開后，高齡夫婦要求再生育的比例明顯增加，不孕癥的發(fā)生率更高[1]。高齡女性卵巢儲備功能下降，需要借助輔助生殖技術(shù)實現(xiàn)妊娠，但是其取卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)大大減少，臨床妊娠率較低[2]。如何改善高齡不孕女性助孕治療結(jié)局是目前臨床研究的熱點。對于卵巢低儲備功能患者主要以促性腺激素釋放激素拮抗劑 (GnRH-A)方案、微刺激方案及高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案為主要促排卵方案，但哪種方案效果更優(yōu)仍存在爭議，而且從卵母細(xì)胞成熟度方面對這3種方案進行比較，國內(nèi)外鮮有研究。因此，本研究通過分析卵母細(xì)胞分泌因子在卵丘顆粒細(xì)胞(CCs)中的表達(dá)情況，預(yù)測不同的促排卵方案對卵母細(xì)胞成熟度及胚胎發(fā)育潛能的影響，為高齡不孕女性尋找更有效的促排卵方案，實現(xiàn)獲卵最大化及尋找胚胎移植機會提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019 年1月至2021 年10月于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)助孕治療的高齡(本研究定義為年齡≥38歲)DOR患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥38 歲；(2)符合卵巢低反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[3]，①抗苗勒氏管激素(AMH)為0.5～1.1 ng/mL或者促卵泡激素(FSH)/促黃體生成素(LH)>3.6；②雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)(AFC)5～7個；③既往有卵巢儲備功能減退(DOR)或卵巢早衰(POF)病史，常規(guī)刺激方案獲卵數(shù)≤3個。滿足以上3 項中任意2 項即為DOR。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方或一方存在染色體異常；(2)合并各種內(nèi)分泌代謝疾病，如甲狀腺功能亢進癥或甲狀腺功能減退癥、糖尿病、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等。本研究共納入80例患者425份CCs。

1.2促排卵方法

1.2.1分組 根據(jù)促排卵方案，隨機分為PPOS方案組(20 例89份CCs)、GnRH-A方案組(30例165份CCs)及微刺激方案組(30例171份CCs)。另外根據(jù)卵母細(xì)胞成熟情況，將卵母細(xì)胞分為GV期、MⅠ期及MⅡ期，MⅡ期根據(jù)受精情況分為正常受精組及異常受精組；正常受精組繼續(xù)培養(yǎng)至第3日，根據(jù)胚胎情況分為優(yōu)質(zhì)胚胎組及非優(yōu)質(zhì)胚胎組；非優(yōu)質(zhì)卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng)至第5日或第6日囊胚期，分為優(yōu)質(zhì)囊胚組及非優(yōu)質(zhì)囊胚組。

1.2.2促排卵方案 微刺激方案：月經(jīng)第2天或第3天開始給予來曲唑(LE，江蘇恒瑞醫(yī)藥集團有限公司)2.5 mg/d或氯米芬(CC) 100 mg/d口服，同時給予注射用尿促性素(HMG，廣州麗珠集團股份有限公司)，起始劑量為75～150 IU/d，5 d后停用LE或CC，根據(jù)患者卵泡大小和激素水平來調(diào)整促性腺激素(Gn)劑量，當(dāng)卵泡直徑為12～14 mm或血清LH水平>5 IU/L,皮下注射醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)0.25 mg,每天1次,直至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日。

GnRH-A方案：于月經(jīng)第2天或第3天開始，給予注射用重組人促卵泡素(果納芬，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)，起始劑量為150～300 IU/d，根據(jù)卵泡大小及激素水平適時調(diào)整Gn劑量，當(dāng)卵泡直徑為12～14 mm，和(或)雌二醇(E2)水平超過400 pg/mL，和(或)LH>5 IU/L時，加用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾有限公司，瑞士)0.25 mg/d，直至注射HCG日。

PPOS方案組：月經(jīng)第2～3天，B超提示卵泡直徑≤7 mm，開始使用地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培制藥有限公司，美國)20 mg/d，同時應(yīng)用HMG(廣州麗珠集團股份有限公司)150～300 IU/d，根據(jù)患者激素水平及卵泡發(fā)育情況來調(diào)整Gn劑量，直至注射HCG日。

當(dāng)雙側(cè)卵巢中直徑≥18 mm的卵泡數(shù)是直徑≥14 mm的卵泡數(shù)的60%～70%,每個卵泡的平均E2水平為200～300 pg/mL時進行扳機,于扳機后36～38 h進行經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下取卵術(shù)。

1.2.3觀察指標(biāo) 取卵后4～6 h采用機械法剝離單個卵子周圍的CCs，使卵母細(xì)胞與單卵丘顆粒細(xì)胞群一一對應(yīng)。觀察GV、MⅠ、MⅡ期卵母細(xì)胞中生長分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的相對表達(dá)量；所有的成熟卵母細(xì)胞均采用ICSI授精，并連續(xù)觀察受精、卵裂及囊胚形成情況。2PN為正常受精，其余為異常受精 。本中心優(yōu)質(zhì)胚胎的評分標(biāo)準(zhǔn)[4]：卵裂球7～9 個、排列規(guī)則、碎片≤20%。Gardner囊胚評分系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)：≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.3卵母細(xì)胞分泌因子檢測方法

1.3.1CCs中RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA提取方法按照Trizol進行。提取的RNA采用瓊脂糖凝膠電泳判定是否合格，然后按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司)說明書進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件如下：70 ℃ 10 min,42 ℃50 min,95 ℃5 min。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA表達(dá)量檢測，按照 QuantiFast?SYBR?Green 試劑盒(德國Qiagen Rotor-Gene Q)說明書進行檢測并收集數(shù)據(jù)：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,共40個循環(huán)。將所得的Ct值按照公式2ΔCt進行計算。

2 結(jié) 果

2.13組患者基線資料比較 3組患者年齡、不孕年限及卵巢功能指標(biāo)等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。GnRH-A方案組采用Gn天數(shù)及Gn劑量明顯多于微刺激方案組和PPOS方案組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者基線資料比較

組別nbLH(mIU/mL)bE2(pg/mL)采用Gn天數(shù)(d)Gn劑量(IU)微刺激方案組304.99±1.1361.77±13.889.55±0.892077.50±153.23PPOS方案組204.62±0.7871.29±17.209.50±1.052061.25±152.06GnRH-A方案組304.64±1.0370.03±18.9010.16±0.91ab2232.50±168.94abP0.4190.1570.024<0.001

2.2總RNA檢測 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA結(jié)果顯示，提取的RNA完整性及純度均較高，符合實驗條件，見圖1。

注：1、2泳道為成熟卵母細(xì)胞RNA;3、4泳道為未成熟卵母細(xì)胞RNA。

2.3聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果 聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物通過電泳檢測驗證可見電泳條帶清晰單一，見圖2。

2.4微刺激方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量 在微刺激促排卵方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于MⅠ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037、P=0.046、P<0.001)； MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于GV期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046、P<0.001、P=0.035)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于異常受精組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001、P=0.012、P=0.048)；優(yōu)質(zhì)胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量均明顯高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007、P=0.015、P=0.003)；優(yōu)質(zhì)囊胚組GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.048、P=0.040、P=0.037)。見表2。

注：1～5泳道分別為100 bp DNA ladder、TGF-β1、核糖體蛋白L/P(RDL-19)、BMP-15、GDF-9。

表2 微刺激方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量

2.5GnRH-A方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量 在GnRH-A方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于MⅠ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029、P=0.025、P=0.049)，MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于GV期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014、P=0.038、P=0.043)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于異常受精組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036、P=0.034、P=0.044)；優(yōu)質(zhì)胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014、P=0.002、P<0.001)；優(yōu)質(zhì)囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029、P=0.049、P=0.045)。見表3。

表3 GnRH-A方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量

2.6PPOS方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量 在PPOS方案組中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于MⅠ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、P=0.049、P=0.023)，MⅠ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于GV期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026、P=0.044、P=0.044)；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于異常受精組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028、P=0.024、P=0.036)；優(yōu)質(zhì)胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026、P=0.040、P<0.001)；優(yōu)質(zhì)囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、P=0.037、P=0.039)。見表4。

表4 PPOS方案組中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量

2.73組在卵母細(xì)胞階段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量比較 GnRH-A方案組GDF-9、BMP-15相對表達(dá)量明顯高于微刺激方案組、PPOS方案組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；微刺激方案組BMP-15相對表達(dá)量明顯低于PPOS方案組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間GDF-9、BMP-15、TGF-β1相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 3組在卵母細(xì)胞階段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量比較

3 討 論

DOR是一種以卵巢內(nèi)可募集的AFC減少和(或)卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致配子生成功能下降，生育力低下的生殖內(nèi)分泌疾病[5]。DOR病因眾多，即使經(jīng)過全面評估，病因仍不明確，主要與遺傳、年齡、自身免疫性疾病、感染性疾病、社會環(huán)境及心理等多種因素有關(guān)[6]。輔助生殖技術(shù)是DOR患者在有限的時間內(nèi)盡快實現(xiàn)生育的重要輔助治療手段，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。目前,如何更有效地預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能，為DOR患者選擇個體化的促排卵方案，在最短的時間內(nèi)最大限度增加獲卵數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要解決的難題之一。

CCs緊緊包繞在卵母細(xì)胞周圍，與卵母細(xì)胞關(guān)系最為緊密，對卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育、成熟、受精發(fā)揮至關(guān)重要的作用。CCs和卵母細(xì)胞通過縫隙連接進行雙向交換，CCs為卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，促進卵母細(xì)胞成熟、排卵及隨后的胚胎發(fā)育，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。同時卵母細(xì)胞調(diào)控CCs的細(xì)胞外基質(zhì)合成及細(xì)胞分化，并積極調(diào)節(jié)CCs的功能，從而控制復(fù)雜的CCs微環(huán)境。CCs基因的表達(dá)譜因卵母細(xì)胞成熟的階段不同而不同。

本研究選取CCs作為研究載體，可以使CCs與卵母細(xì)胞一一對應(yīng)，較壁層顆粒細(xì)胞及卵泡液有更高的同源性、特異性及較低的污染率[7-8]，研究結(jié)果更加精確。本研究首次對高齡患者的單卵丘顆粒細(xì)胞群進行研究，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)來定量檢測卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9、BMP-15及TGF-β1 的相對表達(dá)量。

卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能包括恢復(fù)第1次減數(shù)分裂；受精后能夠正常卵裂；能夠發(fā)育至囊胚期；能足月活產(chǎn)；子代健康[9]。卵母細(xì)胞成熟度包含卵母細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟，只有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同步成熟，卵母細(xì)胞才能成熟，并完成受精及后續(xù)的胚胎發(fā)育[10]。

本研究對高齡患者的胚胎從卵母細(xì)胞到囊胚形成階段進行連續(xù)性研究，且能做到和單卵丘顆粒細(xì)胞群一一對應(yīng)進行觀察及檢測，使結(jié)果更客觀、更精確，從而為胚胎學(xué)醫(yī)生選擇優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞提供更有價值的參考，更好地預(yù)測卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

本課題組最近一項研究顯示，在年齡<35歲患者中，卵母細(xì)胞分泌因子可作為評價卵母細(xì)胞質(zhì)量、預(yù)測卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)[11]。但是卵母細(xì)胞分泌因子在高齡患者中的相對表達(dá)量，以及其對卵母細(xì)胞成熟度及其胚胎發(fā)育潛能的連續(xù)性研究鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，在3種促排卵方案中，MⅡ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量高于MⅠ期和GV期；正常受精組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量高于異常受精組(P<0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組(P<0.05)；優(yōu)質(zhì)囊胚組的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相對表達(dá)量明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)。由此可以看出，上述3 種卵母細(xì)胞分泌因子可作為高齡DOR患者評估卵母細(xì)胞質(zhì)量、預(yù)測卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)。

隨著國家生育政策的實施，尤其是“三孩”政策的放開，高齡生育人群越來越多，DOR患者在生育人群中所占的比例也越來越高，其在輔助生殖過程中，存在Gn用量大，藥物反應(yīng)差，獲卵少，胚胎質(zhì)量差等問題[12]。雖然各種促排卵方案均可用于DOR患者，但是對于DOR患者人群而言，需要減少促排卵時間、提高胚胎質(zhì)量，增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，在最短的時間實現(xiàn)活產(chǎn)。降調(diào)節(jié)方案可能導(dǎo)致卵巢過度抑制，致使促排時間長，Gn用量大、花費較高、再次取卵等待時間長等問題。GnRH-A方案和微刺激方案雖然解決了卵巢過度抑制的問題，且卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生率低，但微刺激方案早發(fā)LH峰導(dǎo)致的周期取消率高，新鮮周期移植率低，取卵周期次數(shù)增加，同時早期LH升高還可能會影響卵子質(zhì)量[13],使可利用胚胎數(shù)減少，延長妊娠時間；GnRH-A方案可以迅速抑制LH升高的問題，防止卵泡提早黃素化或排卵，降低周期取消率，但DOR患者更易引發(fā)突發(fā)LH峰，同時伴有E2水平降低，易造成非預(yù)期的排卵，使周期取消率增加，需要及時識別突發(fā)的LH峰，及早處理。同時，拮抗劑的添加可導(dǎo)致FSH及LH的迅速下降，致使卵泡發(fā)育變慢，雌激素水平下降，可能增加Gn用量和采用Gn天數(shù)，使周期花費稍微增高。PPOS方案能夠有效預(yù)防早發(fā)LH峰，降低周期取消率，而且具有Gn周期短、費用低、用藥方便等優(yōu)點,近年來被廣泛應(yīng)用于DOR患者。沈秀等[14]將PPOS方案應(yīng)用于FSH升高的DOR患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效抑制LH峰，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。最近的研究也表明，PPOS方案較超短方案及微刺激方案，能夠有效抑制早發(fā)LH峰，而且卵泡數(shù)量、卵子質(zhì)量、可利用胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)更多[15-16]。但PPOS方案使卵泡在發(fā)育過程中始終處于高孕激素狀態(tài),過早使孕酮作用于子宮內(nèi)膜，導(dǎo)致胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜容受性之間的同步中斷,影響卵泡與子宮內(nèi)膜的同步化,需要全胚冷凍和延遲移植[17-18]。因此，尋找合適的促排卵方案，盡快獲取高質(zhì)量的卵子和優(yōu)質(zhì)胚胎是改善DOR患者輔助生殖臨床結(jié)局的關(guān)鍵。

本研究分析了高齡不孕患者的卵母細(xì)胞分泌因子相對表達(dá)量，且在不同促排卵方案之間進行比較，以期找到更適合高齡DOR患者的促排卵方案。本研究按促排卵方案分為微刺激方案組、GnRH-A方案組和PPOS方案組。TGF-β1的相對表達(dá)量在不同促排卵方案組中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而GDF-9及BMP-15在不同促排卵方案組中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但GnRH-A方案組采用Gn天數(shù)及Gn劑量明顯多于其余兩組(P<0.05)。筆者認(rèn)為不同的促排卵方案可能影響卵母細(xì)胞分泌因子的表達(dá)情況，從而影響卵母細(xì)胞的成熟度及其后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能，與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。

本研究的不足之處：樣本量較少，分析結(jié)果可能存在一定的偏倚，還需要開展大樣本、多中心研究；本研究因大多數(shù)患者未進行胚胎移植，因此未進行臨床妊娠結(jié)局的比較，在以后的臨床工作中，本課題組會繼續(xù)跟蹤觀察這些患者的妊娠情況；目前，這3種方案對于年齡<35歲，卵巢儲備功能正?；颊叩膽?yīng)用也越來越普遍，因本中心對于卵巢儲備功能正常的患者應(yīng)用PPOS方案較晚，本研究未與年齡較小、卵巢儲備功能正常的患者進行比較，后續(xù)本課題組會進行深入研究。

綜上所述，卵母細(xì)胞分泌因子 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相對表達(dá)量可以作為評價卵母細(xì)胞成熟度和發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)，為高齡患者提高妊娠率提供理論基礎(chǔ)。對于DOR患者，GnRH-A方案可以有效抑制LH峰，降低周期取消率，但Gn用量增加，周期花費較高；微刺激方案采用Gn天數(shù)更少、Gn用量低，對卵巢刺激小，但易出現(xiàn)早發(fā)LH峰，周期取消率高；PPOS方案能有效抑制LH峰，Gn用量少、花費較少，但因孕激素過早作用于子宮內(nèi)膜，使卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，不能行新鮮周期移植，需行全胚冷凍。因此，臨床可根據(jù)DOR患者具體情況進行個體化的治療，選擇更合適的方案。