miR-223、TLR2在新生兒感染性肺炎治療中的變化與應(yīng)用*

蔣斐斐,孫麗芃,李亞楠

安徽省亳州市人民醫(yī)院兒科,安徽亳州 236800

新生兒感染性肺炎是指新生兒在宮內(nèi)、分娩過(guò)程中或出生后吸入胎糞、羊水、胃內(nèi)容物等，或是娩出后感染細(xì)菌、病毒等病原體，導(dǎo)致的肺部炎癥病理改變[1]。臨床上，根據(jù)新生兒感染性肺炎病因可分為吸入性肺炎與感染性肺炎兩種[1]，且不同類型肺炎發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)差異不明顯，導(dǎo)致臨床診療難度較大。臨床上以新生兒感染性肺炎更為常見(jiàn)[2-3]，故本研究選擇新生兒感染性肺炎進(jìn)行研究。病原學(xué)檢查是新生兒感染性肺炎常用的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，能指導(dǎo)臨床治療，但是該診斷方法所需時(shí)間長(zhǎng)[4-5]。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼核苷酸，與機(jī)體免疫功能存在明顯的差異性。外周血miR-223在肺炎患兒中呈高表達(dá)，能作為肺炎早期診斷指標(biāo)之一，用于評(píng)估患兒病情嚴(yán)重程度[6]。Toll樣受體2(TLR2)是Toll家族成員之一，在人體中具有廣泛的作用，可識(shí)別不同類型病原微生物抗原成分，但是該指標(biāo)在新生兒感染性肺炎中的應(yīng)用研究較少[7]。因此，本研究將新生兒感染性肺炎患兒納入研究，旨在探討miR-223、TLR2在新生兒感染性肺炎中的表達(dá)情況及對(duì)臨床診斷的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年5月至2021年3月本院收治的67例新生兒感染性肺炎患兒作為觀察組，男34例、女33例，日齡0～32 d，平均(13.58±4.51)d，孕周38～42周、平均(40.13±1.75)周，母親分娩次數(shù)1～3次、平均(1.65±0.51)次，分娩方式：順產(chǎn)39例、剖宮產(chǎn)28例。另外，將本院同期健康新生兒51例作為對(duì)照組，男32例、女19例，日齡4～33 d、平均(13.62±4.56)d，孕周37～42周、平均(40.06±1.71)周，分娩方式：順產(chǎn)40例、剖宮產(chǎn)11例。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。受試者家屬均簽署知情同意書(shū)。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀察組患兒符合新生兒感染性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)血常規(guī)、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查確診；(2)均能配合完成miR-223、TLR2檢查；(3)單胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有先天畸形、一般情況較差或器質(zhì)性疾??；(2)伴有其他感染性疾病及嚴(yán)重肝、腎功能異常；(3)研究期間死亡或轉(zhuǎn)上一級(jí)醫(yī)院；(4)有藥物過(guò)敏史、禁忌證。

1.2儀器與試劑 FSCS Vantage流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Biometra公司；MX3000PTM熒光定量PCR儀購(gòu)自Stratagene公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京博湃生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。酶免檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；VIDAs全自動(dòng)熒光免疫分析儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；RNA提取Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TLR2相關(guān)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；降鈣素原(PCT)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及保存 根據(jù)患兒病原學(xué)檢查結(jié)果和病情，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的治療，分別于治療前、后抽取靜脈血3 mL。對(duì)照組采集臍帶血3 mL，以2 000 r/min離心10 min，分離得到血清，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待測(cè)。

1.3.2miR-223檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定miR-223水平，利用Trizol法提取血液標(biāo)本的總RNA，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度。將總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃ 20 min，35 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板8 μL、SYBRP Green 10 μL、PCR Primer mix 2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，連續(xù)完成40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血液標(biāo)本中miR-223的相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3.3治療方案 觀察組均給予常規(guī)對(duì)癥支持治療，具體方法如下:給予抗感染、平喘及退熱等治療，7 d治療后評(píng)估效果[9-10]。觀察組治療后記錄為觀察組-T。

1.3.4指標(biāo)的測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定TLR2的表達(dá)水平(檢測(cè)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)，取血液標(biāo)本100 μL于流式細(xì)胞管，加入FITC-抗TLR2抗體10 μL，快速震蕩混勻，室溫下避光孵育15 min。將流式細(xì)胞管以2 000 r/min離心5 min后棄上清，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA測(cè)定IL-6水平；采用全自動(dòng)熒光免疫分析儀測(cè)定降鈣素原(PCT)水平[11]。

2 結(jié) 果

2.1血清miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平比較 治療前觀察組的miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組治療7 d后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均低于治療前(P<0.05)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清miR-223、TLR2、IL-6、PCT水平的比較

2.2檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示：血清miR-223與TLR2、IL-6、PCT水平均呈正相關(guān)(r=0.492、0.489、0.503，P<0.05)，TLR2與IL-6、PCT水平亦呈正相關(guān)(r=0.465、0.542，P<0.05)。

2.3miR-223、TLR2對(duì)新生兒感染性肺炎的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示：用于新生兒感染性肺炎的診斷，miR-223的最佳截?cái)嘀禐?.12，曲線下面積(AUC)為0.715，TLR2的最佳截?cái)嘀禐?.11，AUC為0.753。miR-223、TLR2聯(lián)合診斷新生兒感染性肺炎的AUC為0.894，明顯高于miR-223、TLR2單項(xiàng)診斷的AUC(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 miR-223、TLR2單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)新生兒感染性肺炎的診斷價(jià)值分析

圖1 miR-223、TLR2單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)用于新生兒感染性肺炎的診斷的ROC曲線

3 討 論

新生兒感染性肺炎是兒科常見(jiàn)病、多發(fā)病，由于多數(shù)患兒發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，導(dǎo)致患兒診療難度較大[12]。同時(shí)，新生兒特殊的生理與免疫狀態(tài)，導(dǎo)致新生兒感染性肺炎發(fā)生率較高，隨著病程延長(zhǎng)，將會(huì)增加窒息、呼吸衰竭的發(fā)生率。目前新生兒感染性肺炎診療難度大，本研究旨在探討新生兒感染性肺炎新的診斷標(biāo)志物。

miR-223屬于miRNA的一種[13]。miR-223在人體中具有廣泛的生物學(xué)作用，如參與免疫細(xì)胞譜系的發(fā)生、分化調(diào)控，維持免疫穩(wěn)態(tài)等[14]。miR-223在膿毒癥患兒和小兒肺炎支原體感染患者中均呈高表達(dá)[15-16]，而且與T淋巴細(xì)胞亞群、炎癥因子密切相關(guān)[17]。由此可見(jiàn)，miR-223異常表達(dá)可能與新生兒感染性肺炎存在緊密聯(lián)系[18]。本研究顯示:觀察組miR-223、IL-6及PCT水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-223在新生兒感染性肺炎患者中高表達(dá)。

TLR2是新發(fā)現(xiàn)的先天性免疫的病原模式識(shí)別受體，可介導(dǎo)跨膜信號(hào)，激活機(jī)體免疫反應(yīng)。Toll受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能激活機(jī)體炎性反應(yīng)，并產(chǎn)生瀑布聯(lián)級(jí)反應(yīng)，可清除機(jī)體內(nèi)的病原體[19]。重癥肺炎患者外周血TLR2、TLR4表達(dá)水平升高，與炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示：觀察組TLR2、IL-6及PCT水平高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明TLR2在新生兒感染性肺炎患者中高表達(dá)。

目前臨床上對(duì)于新生兒感染性肺炎以對(duì)癥支持治療為主。本研究對(duì)新生兒感染性肺炎患兒均給予對(duì)癥支持治療。觀察組治療7 d后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均低于治療前(P<0.05)，觀察組治療后miR-223、TLR2及IL-6、PCT述評(píng)均明顯降低(P<0.05)，而且觀察組治療后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-223、TLR2在新生兒感染性肺炎治療后水平降低，能較好反映患兒肺炎治療的效果。本研究進(jìn)一步分析了miR-223、TLR2在新生兒感染性肺炎診斷中的價(jià)值。miR-223、TLR2聯(lián)合檢測(cè)用于診斷的靈敏度與特異度均高于miR-223、TLR2單項(xiàng)檢測(cè)。血清miR-223與TLR2、IL-6及PCT水平呈正相關(guān)，并且TLR2與IL-6及PCT水平也呈正相關(guān)。提示血清miR-223和TLR2與IL-6及PCT一樣具有早期診斷新生兒感染性肺炎的能力。因此，臨床上對(duì)于疑似新生兒感染性肺炎者，應(yīng)加強(qiáng)miR-223、TLR2水平測(cè)定，從而輔助診斷。

綜上所述，miR-223、TLR2在新生兒感染性肺炎中呈高表達(dá)，而且二者聯(lián)合測(cè)定具有較高的靈敏度與特異度，能為新生兒感染性肺炎的診療提供參考依據(jù)。但是，本研究中亦存在諸多局限性與不足，研究中納入病例數(shù)較少，需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行研究。