鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片氨基酸代謝過程的影響

劉建新，劉瑞瑞，劉秀麗，歐曉彬，賈海燕，卜婷，李娜

（甘肅省隴東生物資源保護利用與生態(tài)修復重點實驗室，隴東學院生命科學與技術(shù)學院，甘肅 慶陽 745000）

土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展和威脅生態(tài)安全的世界性環(huán)境問題［1］。我國內(nèi)陸地區(qū)的鹽堿地主要為鹽（NaCl、Na2SO4）堿（NaHCO3、Na2CO3）復合類型［2］。植物遭受鹽堿復合脅迫時在滲透脅迫和營養(yǎng)失衡基礎(chǔ)上協(xié)同疊加高pH脅迫，對植物造成的傷害遠大于單一鹽脅迫或堿脅迫［3］。目前，有關(guān)植物抗鹽堿機制的探究多集中在鹽脅迫方面，對堿脅迫和鹽堿復合脅迫涉及相對較少。鹽堿復合脅迫下，植物會重構(gòu)體內(nèi)碳氮代謝平衡，使碳代謝向氮代謝偏移，積累更多如脯氨酸、游離氨基酸等含氮有機物來加強滲透調(diào)節(jié)，以增強鹽堿適應(yīng)能力［4-5］。研究表明，植物氨基酸代謝積累與其耐鹽性密切相關(guān)［6］。鹽脅迫下，植物葉片中重要氨基酸顯著積累［7］，參與滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除和離子運輸，緩解鹽脅迫對葉肉細胞的生理傷害［8-9］。堿脅迫強烈影響水稻（Oryza sativa）氨基酸的代謝［10］，且氨基酸代謝的獨特調(diào)節(jié)與小麥（Triticum aestivum）品種對短暫干旱的耐受性增強有關(guān)［11］。目前，有關(guān)植物氨基酸代謝對鹽堿復合脅迫的響應(yīng)及外源信號對其響應(yīng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)仍尚不清楚。

植物氣體信號硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）參與許多生理過程調(diào)控，能夠增強植物對非生物脅迫的抗性［12］。研究表明，鹽脅迫下，H2S可抑制紫花苜蓿（Medicago sativa）細胞鉀離子外流［13］；維持水稻礦質(zhì)離子平衡［13］和降低大麥（Hordeum vulgare）鈉鉀比［14］；提高茶樹（Camellia sinensis）［15］和玉米（Zea mays）［16］活性氧清除能力。外源H2S參與鹽堿脅迫下植物可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸代謝調(diào)控[4,17]，且隨H2S濃度和處理時間[4]及植物生育期不同[18]對可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸代謝存在正負調(diào)控。裸燕麥（Avena nuda）是我國北方和西部地區(qū)種植的禾本科燕麥屬糧飼兼用型作物［19］，其籽粒含有高于常見禾谷類作物的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，并富含膳食纖維β-葡聚糖和燕麥黃酮，具有豐富營養(yǎng)和降低血清膽固醇的作用，成為美國食品和藥物管理局批準的第一個“具有降低心臟病風險”的谷物保健食品［20］。甘肅省中部地區(qū)是我國裸燕麥的主產(chǎn)區(qū)之一，裸燕麥也是當?shù)剞r(nóng)民增收和改善膳食結(jié)構(gòu)的重要雜糧，但西部土壤的鹽堿化嚴重影響裸燕麥的生長發(fā)育和產(chǎn)量提高。本試驗采用盆栽土培試驗，模擬甘肅省中部土壤鹽堿含量和組成，研究噴施H2S供體硫氫化鈉（NaHS）對鹽堿復合脅迫下裸燕麥氨基酸代謝過程的調(diào)控效應(yīng)，以期揭示H2S增強植物耐鹽堿性的生理機制，為探索利用H2S緩解植物鹽堿脅迫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

裸燕麥品種‘定莜9號’種子購自甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學研究院；NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3、NaHS購自上海生工生物工程股份有限公司；復合肥從甘肅省慶陽市田田圈農(nóng)化有限公司購買。

1.2 材料培養(yǎng)

盆栽土培試驗于2021年4-8月在甘肅省隴東生物資源保護利用與生態(tài)修復重點實驗室生物科技園進行。供試土壤取自隴東黃土高原（107°41′4″E，35°43′50″N）黑壚土耕作層（0～20 cm），砂壤土質(zhì)地。將土樣風干、過3 mm篩，備用。土壤基本性狀：有機質(zhì)11.83 g·kg-1，速效氮37.4 mg·kg-1，速效磷（P2O5）7.25 mg·kg-1，速效鉀（K2O）182.5 mg·kg-1，水溶性總鹽含量0.773 g·kg-1，pH 7.92。試驗用塑料盆口徑31.5 cm，高34.0 cm，配底托。

過篩土樣分兩組：一組中不添加中性鹽（NaCl、Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）；另一組模擬甘肅省中部土壤鹽堿含量和組成添加質(zhì)量分數(shù)為3.00 g·kg-1（包括土壤鹽堿背景值）的中性鹽和堿性鹽（摩爾比NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3=12∶8∶1∶9）。兩組土樣中均按0.5 g·kg-1（土）加入氮-磷-鉀（13-17-15）復合肥和0.269 L·kg-1（土）有機草碳基質(zhì)以供給養(yǎng)分和防土壤板結(jié)，各自充分拌勻后裝盆，每盆裝土22.0 kg。每盆澆5.0 L自來水至田間持水量75%左右，沉實3 d后播種（4月6日），種子用質(zhì)量分數(shù)為0.2%的50%多菌靈粉劑拌種12 h以預防裸燕麥黑穗病。每盆播種大約60粒種子，播后覆土2～3 cm，常規(guī)管理。5月9日定苗，每盆保留一致壯苗25株。裸燕麥生長至6月18日抽穗期（前期試驗確定的最佳噴施時期）時進行噴施處理。

1.3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置4個處理：1）以盆土中不添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施蒸餾水作為對照（CK）；2）以盆土中添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施蒸餾水作為鹽堿脅迫處理（salt-alkali stress，SA）；3）以盆土中添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施50 μmol·L-1NaHS溶液作為鹽堿脅迫下噴施H2S處理（SA+NaHS）；4）以盆土中不添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施50 μmol·L-1NaHS溶液作為單一H2S處理（NaHS）。每處理6盆（3盆用作氨基酸等指標檢測取樣，另3盆用于成熟后籽粒產(chǎn)量統(tǒng)計），4次重復，復拉丁方設(shè)計排布，共192盆。

用手持壓縮式噴霧器（成都市鑫桂塑膠有限公司）每天早晚葉面各噴施一次，連續(xù)噴施3 d。為提高噴施液與葉面的黏附性，噴施液中添加體積分數(shù)為0.01%的Tween-80，每盆噴施量150 mL左右。噴施結(jié)束后第7天剪取植株倒數(shù)第2片葉，用吸水紙擦拭干凈，裝入凍存管置液氮速凍后，一部分轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱保存，用于總游離氨基酸和丙二醛含量測定；另一部分用干冰包埋、打包郵寄至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司檢測氨基酸含量。7月20日裸燕麥成熟后收獲測定籽粒產(chǎn)量。

1.4 測定項目與方法

采用茚三酮顯色法測定總游離氨基酸含量［21］；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法測定［21］。22種氨基酸組分含量委托蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司用美國產(chǎn)Waters品牌UPLC型液相色譜（liquid chromatography，LC）儀和Ab Sciex品牌AB5000型質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀檢測。7月20日裸燕麥成熟后收獲，脫粒、除雜風干后用千分之一精度天平稱量每盆籽粒的重量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)，運用SPSS 20.0軟件進行一般線性模型單變量無交互拉丁方設(shè)計多因素方差分析，鄧肯法多重比較（顯著水平為0.05）。用Simca 14.1軟件對氨基酸組分含量進行等方差縮放后偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和隱結(jié)構(gòu)正交投影判別分析（orthogonal projection to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA），篩選差異氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片總游離氨基酸含量的影響

與CK相比，SA處理使裸燕麥葉片總游離氨基酸含量下降了13.94%（圖1），差異顯著。與SA處理相比，SA+NaHS處理的總游離氨基酸含量提高了5.02%，差異不顯著。與CK相比，單獨NaHS處理的總游離氨基酸含量下降了2.18%，差異不顯著。

圖1 鹽堿脅迫下外源H2S對裸燕麥葉片總氨基酸含量的影響Fig.1 Effects of exogenous hydrogen sulfide on total amino acid content in naked oat leaves under salt-alkali stress

2.2 不同處理下裸燕麥葉片氨基酸含量的變化軌跡

利用LC-MS檢測出裸燕麥葉片中共21種氨基酸，其含量差異頗大（表1）。不同處理下的裸燕麥葉片中Gln、Lys、GABA、Ala和Leu 5種氨基酸的含量較高，置 信 區(qū)間在187.562～607.63 μg·g-1FW之 間；Ser、Val、Thr、Asp、Phe、Arg和Tyr 7種氨基酸含量次高，置信區(qū)間在65.348～167.93 μg·g-1FW之間；Gly、Pro、Ile、Asn、Met、His和Trp 7種氨基酸的含量中等，置信區(qū)間在10.285～167.935 μg·g-1FW之間；Orn和Glu 2種氨基酸的含量較低，置信區(qū)間分別為0.303～1.565 μg·g-1FW和1.094～12.342 μg·g-1FW。

運用差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示初始值至最終值的變化程度，取差異倍數(shù)的對數(shù)值反映差異變化的相對大小。以CK為初始值，log2FC是正值表示上調(diào)，負值表示下調(diào)。從表1可見，與CK相比，SA處理下裸燕麥葉片中只有Orn和Arg上調(diào)，其他19種氨基酸均下調(diào)。與SA處理相比，SA+NaHS處理下Gly、GABA、Pro、Ile、Leu、Gln、Lys、Glu、Met、Phe、Arg、Tyr、Trp 13種氨基酸上調(diào)，Ala、Ser、Val、Thr、Asn、Orn、Asp、His 8種氨基酸下調(diào)。與CK相比，單獨NaHS處理下GABA、Ser、Asp、His、Trp、Arg、Phe 7種氨基酸上調(diào)，Gly、Ala、Pro、Val、Thr、Ile、Leu、Asn、Orn、Gln、Lys、Glu、Met、Tyr 14種氨基酸下調(diào)。表明外源硫化氫正負調(diào)控正常和鹽堿脅迫下裸燕麥不同氨基酸積累。

表1 不同處理下裸燕麥葉片中個別氨基酸含量的置信區(qū)間及差異倍數(shù)Table 1 Confidence interval and fold change（FC）for the content of individual amino acids in naked oat leaves under different treatments

2.3 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片不同合成途徑氨基酸組成的顯著性分析

為明確鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥不同氨基酸積累的顯著影響，進一步分析了3-磷酸甘油酸（Gly、Ser）、α-酮戊二酸（Orn、Glu、Gln、Pro、Arg、His、GABA）、丙酮酸（Ala、Val、Leu）、芳香族（Phe、Tyr、Try）和草酰乙酸（Asp、Asn、Met、Thr、Lys、Ile）合成途徑中氨基酸含量的變化。由圖2可知，與CK相比，SA處理顯著降低了Gly、Ser、Glu、Pro、GABA、Ala、Val、Tyr、Asn、Thr、Ile含量，顯著提高了Arg含量，而Orn、Gln、His、Leu、Phe、Trp、Asp、Met、Lys含量的變化不顯著。與SA處理相比，SA+NaHS處理顯著提高了Gln、Arg含量，降低了Orn、Asn含量，Gly、Ser、Glu、Pro、His、GABA、Ala、Val、Leu、Phe、Tyr、Trp、Asp、Met、Thr、Lys、Ile含量變化不顯著。與CK相比，單獨NaHS處理顯著提高了Arg、Asp含量，降低了Gly、Orn、Glu、Gln、Val、Asn、Ile含量，而Ser、Pro、His、GABA、Ala、Leu、Phe、Tyr、Trp、Met、Thr、Lys含量無顯著變化。

圖2 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片中3-磷酸甘油酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、芳香族和草酰乙酸途徑氨基酸含量的影響Fig.2 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of individual amino acids in the 3-phosphoglycerate，αketoglutarate，pyruvate，aromatic，and oxaloacetate pathways in naked oat leaves under saline-alkali stress

2.4 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片氨基酸組成的主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種通過多元線性組合提取盡可能多的原始數(shù)據(jù)信息綜合變量的無監(jiān)督降維統(tǒng)計分析方法［22］。經(jīng)PCA分析觀察裸燕麥葉片氨基酸含量的變化（圖3），分析結(jié)果擬合3個主成分，解釋模型差異的決定系數(shù)R2X=0.751，預測模型差異的擬合優(yōu)度Q2=0.535，R2X-Q2=0.216＜0.3，說明模型擬合效果較好。從圖3A可以看出：不同處理裸燕麥葉片氨基酸組成存在明顯差異，CK、NaHS處理與SA、SA+NaHS處理在第一主成分（PC1）上區(qū)分開來，SA與SA+NaHS處理在第二主成分（PC2）上相區(qū)別。另外，SA處理點相對聚集，說明SA處理組內(nèi)樣品氨基酸含量差異較??；而CK、NaHS和SA+NaHS處理點相對分散，說明組內(nèi)樣品之間氨基酸含量差異較大。從得分圖與載荷圖（圖3B）、雙標圖（圖3C）結(jié)合分析可知，SA+NaHS處理的Arg、Gln含量非常高，而Asp、Glu、Asn、Ser、Thr、Ala、Gly、Ile、GABA含量較低；CK則正好相反；SA處理的Phe、Lys、Met、Leu、Trp、Tyr、His、Pro等含量很低，單獨NaHS處理的這些氨基酸含量則較高。上述結(jié)果說明，不同處理使裸燕麥葉片氨基酸含量發(fā)生顯著改變。

圖3 不同處理下裸燕麥葉片氨基酸含量的主成分分析得分圖（A）、載荷圖（B）和雙標圖（C）Fig.3 Principal component analysis scores plot（A），loading plot（B），and biplot（C）of amino acid content in naked oat leaves under different treatments

2.5 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片氨基酸組成的PLS-DA分析

PLS-DA是常用的有監(jiān)督判別分析方法，R2X、R2Y和Q2各自代表模型對矩陣X、Y的擬合度和預測能力［22］。將裸燕麥葉片氨基酸含量經(jīng)PLS-DA分析得到R2X=0.863，R2Y=0.873，Q2=0.732，說明模型擬合較好。由圖4A可見，CK、NaHS、SA、SA+NaHS處理各自歸為一類，表明4個不同處理間氨基酸含量存在明顯差異。經(jīng)200次置換檢驗（圖4B）結(jié)果顯示，置換檢驗中隨機產(chǎn)生的R2在縱軸上的截距小于0.4，Q2值在縱軸上的截距小于0.05。說明PLS-DA沒有出現(xiàn)模型過擬合現(xiàn)象，可以依據(jù)PLS-DA分析獲得的變量投射重要度（variable importance for the projection，VIP）值篩選差異代謝物。根據(jù)VIP＞1且方差分析P＜0.05篩選出6種（Orn、Glu、Gln、Ser、Asp、Arg）差異氨基酸。

圖4 不同處理下裸燕麥葉片氨基酸PLS-DA得分圖及200次模型的置換檢驗Fig.4 PLS-DA score plot of naked oat leaves under different treatment and 200 permutation test of the model

2.6 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片氨基酸組成的OPLS-DA分析

為進一步提高模型參數(shù)對矩陣X/Y關(guān)聯(lián)度的解釋，將不同處理裸燕麥葉片氨基酸進行OPLS-DA分析。結(jié)果表明（圖5A、C、E）：CK、SA、SA+NaHS、NaHS處理各自聚為一族，充分顯示處理間氨基酸含量存在明顯差異。根據(jù)OPLS-DA分析的VIP＞1且95%置信區(qū)間不包括零篩選并結(jié)合S-圖解析可知：與CK相比，SA處理下含量顯著上調(diào)的差異氨基酸是Arg，顯著下調(diào)的氨基酸有10種，依次是Glu、Thr、Ser、Gly、Leu、Ile、Ala、Val、Tyr、Asn（圖5B）；與SA處理相比，SA+NaHS處理Orn、Asn含量顯著下調(diào)，Gln、Tyr、Arg、Leu、Pro含量顯著上調(diào)（圖5D）；與CK相 比，NaHS處 理Arg、Asp含量顯 著 上 調(diào)，而Glu、Orn、Gly、Thr、Gln、Ile含 量 顯 著 下調(diào)（圖5E）。

圖5 不同處理下裸燕麥葉片氨基酸含量OPLS-DA得分圖（A、C、E）和S形圖（B、D、F）Fig.5 OPLS-DA score plot（A，C，E）and S-plot（B，D，F(xiàn)）of amino acid contents in naked oat leaves under different treatment

2.7 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片丙二醛含量和籽粒產(chǎn)量的影響

細胞膜脂氧化產(chǎn)物丙二醛含量的大小反映細胞膜氧化損傷的程度，產(chǎn)量高低是作物適應(yīng)鹽堿環(huán)境能力的直接反映［3，18］。從圖6可知：與CK相比，SA處理顯著提高了裸燕麥葉片丙二醛含量33.01%，而籽粒產(chǎn)量顯著下降了43.56%；SA+NaHS處理與SA處理相比丙二醛含量顯著下降了27.00%，籽粒產(chǎn)量顯著提高了52.83%；單獨NaHS處理的丙二醛含量和籽粒產(chǎn)量與CK差異不顯著。表明外源硫化氫能夠緩解鹽堿脅迫誘導的裸燕麥氧化損傷和同化物積累抑制。

3 討論

植物體游離氨基酸參與細胞離子運輸、酶促反應(yīng)和滲透調(diào)節(jié)，其代謝積累與植物鹽堿耐性密切關(guān)聯(lián)［6，22-23］。鹽脅迫導致花棒（Hedysarum scoparium）葉片總游離氨基酸含量顯著升高［7］，堿脅迫引起小麥［24］和水稻［10］葉片總游離氨基酸含量顯著減少。本試驗結(jié)果表明，鹽堿復合脅迫造成裸燕麥葉片總游離氨基酸含量顯著下降（圖1），其原因可能主要是高pH脅迫抑制氮的吸收［25］。外源硫化氫對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片總游離氨基酸含量下降的緩解效應(yīng)沒有統(tǒng)計學意義（圖1），但它顯著正負調(diào)控鹽堿復合脅迫下裸燕麥葉片不同氨基酸的積累（圖2）。表明外源硫化氫參與鹽堿脅迫下裸燕麥氨基酸代謝的調(diào)控。Aidoo等［11］研究表明，氨基酸代謝的獨特調(diào)節(jié)與植物耐逆性增強有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，外源硫化氫能夠顯著減輕鹽堿復合脅迫誘導的裸燕麥葉片丙二醛含量的升高（圖6A），并有效消減鹽堿復合脅迫造成的裸燕麥籽粒產(chǎn)量的下降程度（圖6B）。這與外源硫化氫可有效緩解鹽脅迫對青錢柳（Cyclocarya paliurus）［26］、小麥［27］和堿脅迫對水稻［28］等生長抑制的結(jié)果一致。由此推測，外源硫化氫對氨基酸代謝過程的調(diào)控可能是其增強裸燕麥耐受鹽堿脅迫能力的重要機制之一。

圖6 鹽堿脅迫下外源硫化氫對裸燕麥葉片丙二醛含量和籽粒產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of exogenous hydrogen sulfide on malondialdehyde content in leaves and grain yield of naked oat under salt-alkali stress

植物氨基酸的組成和積累水平對其適應(yīng)逆境至關(guān)重要［24］。本試驗發(fā)現(xiàn)，裸燕麥葉片中氨基酸含量相差巨大，檢出的21種氨基酸中谷氨酰胺、賴氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸和亮氨酸的含量較高（置信區(qū)間187.562～607.63 μg·g-1FW），鳥氨酸和谷氨酸的含量較低（置信區(qū)間0.303～12.342 μg·g-1FW）（表1）。與對照比較，其他3個處理的裸燕麥葉片中氨基酸log2FC為-2.728～1.182（表1）。說明環(huán)境因素對裸燕麥氨基酸存在較大影響。方差分析顯示，鹽堿復合處理顯著降低了裸燕麥葉片甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸含量，卻顯著提高了精氨酸含量（圖2）。這與燕輝等［7］的鹽脅迫顯著提高花棒葉片脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸含量的結(jié)果不同，也與Wu等［10］的堿脅迫顯著降低水稻葉片精氨酸含量和提高絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量的結(jié)果相反。這可能與植物種類、脅迫類型、強度和時間等有關(guān)。目前，外源硫化氫對鹽堿脅迫下植物氨基酸代謝的調(diào)控未見報道。本試驗發(fā)現(xiàn)，外源硫化氫顯著提高鹽堿復合脅迫下裸燕麥葉片谷氨酰胺和精氨酸含量，卻顯著降低鳥氨酸和天冬酰胺含量（圖2）。說明外源硫化氫參與鹽堿脅迫下裸燕麥氨基酸積累的調(diào)控。這可能與硫化氫能夠誘導鹽堿脅迫下植物氨基酸代謝相關(guān)蛋白表達有關(guān)［29］。

鹽堿脅迫下，植物往往通過氨基酸代謝途徑的改變使一些氨基酸大量積累［7，24］，從而參與細胞滲透調(diào)節(jié)和自由基清除［8-9］，維持功能蛋白和代謝酶的穩(wěn)定性［30］。組成植物蛋白質(zhì)和酶的氨基酸從合成碳架來源可分成3-磷酸甘油酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、草酰乙酸和芳香族5大類［31］。PCA分析結(jié)果表明，鹽堿脅迫或外施硫化氫使裸燕麥葉片不同氨基酸含量發(fā)生顯著改變（圖3）。PLS-DA（圖4）和OPLS-DA（圖5）分析可將不同處理間裸燕麥含量差異的氨基酸進行高效區(qū)分：鹽堿復合脅迫下裸燕麥葉片中α-酮戊二酸族的精氨酸含量顯著上調(diào)；含量顯著下調(diào)的是α-酮戊二酸族的谷氨酸，草酰乙酸族的蘇氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸，3-磷酸甘油酸族的絲氨酸、甘氨酸，丙酮酸族的亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸，芳香族的酪氨酸（圖5和圖7）。精氨酸是一種氮碳比最高的氨基酸，除作為蛋白質(zhì)組成外，還是一氧化氮、多胺和脯氨酸等生物合成的前體［32］。精氨酸在裸燕麥葉片中的大量積累，能夠提高細胞亞精胺含量，減輕自由基氧化損傷［33］，從而有效增強裸燕麥適應(yīng)鹽堿脅迫的能力。以糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中間物為合成前體的5大族氨基酸含量的顯著下調(diào)充分說明鹽堿脅迫導致裸燕麥碳氮代謝發(fā)生紊亂。

圖7 OPLS-DA分析提出鹽堿脅迫下外源硫化氫調(diào)控裸燕麥葉片氨基酸代謝途徑Fig.7 Exogenous hydrogen sulfide regulates amino acid metabolism pathways in naked oat leaves under saline-alkali stress obtained from OPLS-DA analysis

外施硫化氫可正負調(diào)控正常條件或鹽堿復合脅迫下裸燕麥中不同途徑氨基酸的代謝（圖7）。鹽堿復合脅迫下，外源硫化氫顯著下調(diào)了裸燕麥葉片中α-酮戊二酸族的鳥氨酸和草酰乙酸族的天冬酰胺含量（圖5D和圖7），原因可能是硫化氫促使天冬酰胺脫氨產(chǎn)生天冬氨酸，天冬氨酸通過三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)換為谷氨酸和谷氨酰胺［34］。外源硫化氫顯著上調(diào)鹽堿復合脅迫下裸燕麥葉片中α-酮戊二酸族的谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸和丙酮酸族的亮氨酸及芳香族的酪氨酸含量，對3-磷酸甘油酸族的氨基酸影響不大（圖5D和圖7）。精氨酸和鳥氨酸同是尿素循環(huán)中重要的中間物，鳥氨酸又是脯氨酸的合成前體。外源硫化氫可能通過加速尿素循環(huán)促進鳥氨酸轉(zhuǎn)化成精氨酸，同時又激活鳥氨酸途徑合成脯氨酸［5］，或抑制鳥氨酸合成酶表達［29］，從而使鳥氨酸含量顯著下降而精氨酸和脯氨酸含量顯著上調(diào)。脯氨酸是一種高溶解度、富含氮和能量的中性氨基酸［7］。脯氨酸在裸燕麥葉片中的積累，在不引起細胞酸堿度改變的同時，能夠降低細胞滲透勢、清除活性氧、穩(wěn)定蛋白質(zhì)和亞細胞結(jié)構(gòu)、維持氧化還原平衡［35］，從而有效緩解鹽堿脅迫對葉肉細胞的傷害。植物體通常還會把鹽脅迫產(chǎn)生的過量氨轉(zhuǎn)化成谷氨酸/谷氨酰胺，或通過谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸進入三羧酸循環(huán)［36］。外源硫化氫可能既促進氨與α-酮戊二酸生成谷氨酸，又促進谷氨酸轉(zhuǎn)化生成谷氨酰胺，從而保持穩(wěn)定的谷氨酸水平，提高谷氨酰胺含量，防止氨毒發(fā)生。鹽堿復合脅迫下，噴施硫化氫使裸燕麥葉片亮氨酸積累表明硫化氫可能加強了裸燕麥呼吸作用，呼吸中糖酵解終產(chǎn)物丙酮酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸，進一步合成了亮氨酸，但具體機制尚待證實。芳香族氨基酸的合成需要以糖酵解途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的4-磷酸赤蘚糖為底物經(jīng)過莽草酸途徑合成莽草酸，進而合成分支酸后轉(zhuǎn)化生成色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸［37］。外源硫化氫對鹽堿復合脅迫下裸燕麥酪氨酸含量的顯著上調(diào)表明其可能參與磷酸戊糖途徑、糖酵解和莽草酸途徑的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)，其原因也許與硫化氫能夠提高鹽堿脅迫下植物分支酸合成途徑相關(guān)酶蛋白表達有關(guān)［29］。然而，硫化氫對植物碳氮代謝協(xié)調(diào)調(diào)控的機制交叉復雜，尚需利用分子生物學等手段深入解析其緩解植物鹽堿脅迫的氮代謝機制。