辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞炎癥反應和氧化應激的影響

齊琳 甄巧霞 劉翠 劉愛賢

(首都醫(yī)科大學附屬北京康復醫(yī)院神經(jīng)康復中心，北京 100144)

腦缺血/再灌注損傷是腦血管疾病之一，將會導致局部腦組織及其功能的損害，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長時間的完全缺血或嚴重缺血會引起梗死〔1，2〕。腦缺血時腦細胞生物電發(fā)生改變，出現(xiàn)病理性慢波，缺血一定時間后再灌注，慢波持續(xù)并加重。顳葉組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)性氨基酸代謝發(fā)生明顯變化，即興奮性氨基酸隨缺血/再灌注時間延長而逐漸降低，抑制性氨基酸在缺血/再灌注早期明顯升高。缺血/再灌注損傷時間越長，腦組織超微結(jié)構(gòu)改變越明顯，呈現(xiàn)不可逆損傷〔3，4〕。辛芍組方由燈盞細辛和赤芍配伍組成，菊科植物燈盞細辛和毛茛科植物赤芍均為傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，兩者進行組方配制為辛芍組方〔5～7〕。但其辛芍組方對腦缺血再灌注損傷的作用及其機制尚不明確。本實驗討論辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞炎癥反應和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物和細胞 辛芍組方(貴州省藥物制劑重點實驗室)；小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞(中科院上海細胞庫)。

1.1.2試劑 胎牛血清、高糖和無糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液(美國Cell Signaling Technology公司)；0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(美國Gibco公司)；細胞計數(shù)(CCK)-8試劑盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(美國Sigma公司)；一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；自噬體熒光染料(美國Enzo Life Sciences公司)。

1.1.3儀器 電子分析天平〔陸冠森生物科技(上海)有限公司〕；臺式低速、高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；高壓滅菌器(日本三洋電器股份有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(深圳市愛特爾電子科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞用含10%胎牛血清和含1%青霉素鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。待細胞生長至80%～90%時進行傳代，0.25%胰蛋白酶EDTA溶液消化細胞，用胰酶終止消化，取傳代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)模型建立 去除細胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，去除殘存成分，加入不含血清、不含抗生素的無糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行OGD 8 h。OGD結(jié)束后，將無糖DMEM培養(yǎng)基替換為完全培養(yǎng)基，在正常條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3細胞分組 建立小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞OGD/R模型，進行細胞培養(yǎng)，不進行其他處理的作為模型對照(Con)組；使用不同濃度(0.31、0.62、1.25 mg/L)的辛芍組方處理建模后的HT22細胞，作為0.31 mg/L組、0.62 mg/L組、1.25 mg/L組；正常培養(yǎng)的HT22細胞作為正常(Normal)組，每組9只。

1.2.4CCK-8檢測細胞活性 各組HT22細胞以1×105個/孔接種細胞于96孔板，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過酶標儀檢測490 nm處吸光度值(OD)。以OD值代表細胞活性。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平 收集各組HT22細胞上清液，-20℃保留備用。嚴格按照TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒說明書的試驗步驟，檢測上清液中各指標水平。

1.2.6試劑盒檢測過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)氧化應激指標含量 收集各組HT22細胞，-20℃保留備用。依照CAT、SOD、MDA檢測試劑盒說明書檢測各氧化應激指標。

1.2.7Western印跡檢測微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相關蛋白(P62)、低氧誘導因子(HIF)-1α 蛋白表達 收集各組HT22細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白樣品中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉，孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加化學發(fā)光底物(ECL)，暗室內(nèi)曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.2.8熒光顯微鏡檢測細胞中自噬體數(shù)量 收集各組HT22細胞，PBS洗滌2次，加入5%胎牛血清預混的和PBS稀釋的自噬體熒光染料(Green Detection漿染試劑稀釋至1∶500，Hoechst33342核染試劑稀釋至1∶1 000)，37℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，使用熒光顯微鏡檢測細胞自噬體數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞活性的影響 與Normal組比較，Con組細胞OD值顯著降低(P<0.05)；與Con組比較，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍組方組細胞OD值顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞炎癥反應的影響 與Normal組比較，Con組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與Con組比較，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍組方組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞氧化應激的影響 與Normal組比較，Con組細胞MDA含量顯著升高，CAT、SOD活性顯著降低(P<0.05)；與Con組比較，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍組方組細胞MDA含量顯著降低，CAT、SOD活性顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.4辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞自噬的活化的影響 與Normal組比較，Con組細胞LC3Ⅱ蛋白表達和自噬小體數(shù)量顯著升高，P62蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與Con組比較，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍組方組LC3Ⅱ蛋白表達和自噬小體數(shù)量顯著降低，P62蛋白表達顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1、表2。

2.5辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞HIF-1α蛋白的影響 與Normal組(1.00±0.10)比較，Con組HIF-1α蛋白表達顯著升高(1.53±0.12，P<0.05)；與Con組比較，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍組方組HIF-1α蛋白(0.86±0.08、0.55±0.05、0.39±0.03)顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2。

表1 辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞活性、炎癥反應、氧化應激的影響

1～5：Normal組、Con組、0.31 mg/L辛芍組方組、0.62 mg/L辛芍組方組、1.25 mg/L辛芍組方組，下圖同圖1 Western印跡檢測LC3Ⅱ、P62蛋白表達

表2 辛芍組方對缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞自噬的 活化的影響

圖2 Western印跡檢測HIF-1α 蛋白表達

3 討 論

在腦缺血再灌注損傷過程中，神經(jīng)元細胞自噬持續(xù)在較高水平，多種自噬相關蛋白參與其中，且高水平的自噬與神經(jīng)元細胞凋亡和死亡水平密切相關〔8，9〕。HIF-1α廣泛參與細胞的多種應激反應，HIF-1α在正常腦組織中低表達，而當大腦發(fā)生缺血缺氧時，HIF-1α表達明顯增高，促進神經(jīng)元細胞凋亡〔10，11〕。

本研究說明，辛芍組方提高了細胞的活性。劉宗炎〔12〕研究表明，辛芍組方能不同程度地提高細胞存活率。劉亭等〔13〕研究表明，辛芍組方抗對腦缺血再灌注損傷具有抗氧化、抗凋亡的作用。

本研究結(jié)果說明，辛芍組方抑制了缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞炎癥水平和氧化應激。劉亭等〔13〕研究表明，辛芍組方對缺血再灌注損傷后的細胞具有保護作用，與減輕細胞內(nèi)氧化應激有密切聯(lián)系。董永喜等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，辛芍組方中燈盞細辛，赤芍單方對腦缺血再灌注損傷大鼠的炎癥水平和氧化應激具有抑制作用。

本研究結(jié)果說明，辛芍組方抑制了缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞自噬活化。已有研究〔15〕與本實驗結(jié)果類似。侯楊〔16〕研究表明，中藥姜黃素抑制了缺血/再灌注損傷的神經(jīng)細胞自噬的活化和降低了HIF-1α蛋白表達水平，對神經(jīng)起到了保護的作用。