曲馬多對坐骨神經(jīng)痛大鼠脊髓c-jun、c-fos表達及星形膠質(zhì)細胞活化的影響

胡濱 王大斌 鄭潔

(1瀘州市人民醫(yī)院疼痛科，四川 瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院麻醉科)

坐骨神經(jīng)痛為坐骨神經(jīng)循行及分布區(qū)域持續(xù)性、陣發(fā)性疼痛的一種神經(jīng)病理性疼痛(NP)，由椎間盤突出、腰椎退行性病變引起〔1〕。坐骨神經(jīng)痛發(fā)病率較高，是臨床研究的熱點之一〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞活化與NP關(guān)系密切，而抑制星形膠質(zhì)細胞活化并阻斷其級聯(lián)反應(yīng)是臨床疼痛治療和鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的關(guān)鍵〔3〕。研究證實，Jun原癌基因(c-jun)與Fos原癌基因(c-fos)可組成二聚體復(fù)合物-活化蛋白(AP)-1〔4〕，而AP-1不僅可通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞活化標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達，促進星形膠質(zhì)細胞活化增生〔5〕，還可通過調(diào)控細胞生存、凋亡、炎癥等通路相關(guān)基因表達，參與多種NP發(fā)生過程〔6〕。故探究c-jun/c-fos通路的調(diào)控作用可能有利于闡明星形膠質(zhì)細胞參與坐骨神經(jīng)痛發(fā)生過程的分子機制。曲馬多又名反胺苯環(huán)醇，為一種中等強度的中樞鎮(zhèn)痛藥，其耐藥性和成癮性較小，可廣泛應(yīng)用于各種原因引起的急慢性中重度疼痛〔7〕，但曲馬多緩解患者疼痛癥狀的分子生物學(xué)機制還不甚明確，且曲馬多對坐骨神經(jīng)痛患者的改善作用報道較少。本研究推測曲馬多可能通過調(diào)控c-jun/c-fos通路蛋白表達抑制星形膠質(zhì)細胞活化，進而緩解坐骨神經(jīng)痛疼痛癥狀，并建立大鼠坐骨神經(jīng)痛模型驗證上述推測。

1 材料及方法

1.1實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重200～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心〔SCXK(粵)2018-0002〕。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會審核批準〔IACUC-01(20160917)〕。大鼠于瀘州市人民醫(yī)院動物房中飼養(yǎng)。

1.2主要試劑及儀器 曲馬多(規(guī)格：1 mg，性狀：干粉，天津阿斯爾生物，貨號：M9-34)；前列腺素(PG)E2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：R31545，上海圻明生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海聯(lián)邁生物，貨號：LMO105)；P物質(zhì)(SP)ELISA試劑盒(貨號：CSB-E08361r，上海振譽生物科技有限公司)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、c-fos、c-jun、激活子蛋白(AP)-1、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、一氧化氮合酶(iNOS)抗體及山羊抗環(huán)氧化酶(COX)-2抗體(貨號：分別為ab7260、ab134122、ab32385、ab230273、ab215288、ab200478、ab136918、ab23672，購自美國Abcam)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad)等。

1.3模型構(gòu)建與藥物干預(yù) 坐骨神經(jīng)痛模型構(gòu)建方法如參照文獻〔8〕所述：大鼠置于無菌操作臺中，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在距尾根部1 cm處切下鼠尾，縫合傷口，切開鼠尾椎間盤，取0.5 mg膠凍樣髓核備用。將大鼠置于俯臥位固定于手術(shù)臺上，無菌條件下行背正中切口，于L5棘突旁5 mm處切開肌肉層，暴露L5～6間孔外神經(jīng)，將0.5 mg髓核漿涂抹黏于此神經(jīng)上，誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)，逐層縫合肌肉、筋膜，用青霉素3萬U術(shù)野肌內(nèi)注射并縫合皮膚后正常飼養(yǎng)。術(shù)后3 d，若觀察到大鼠出現(xiàn)活動頻繁、激惹行為增加且熱刺激反應(yīng)潛伏期(PWL)及機械痛敏閾值(PWT)檢測結(jié)果異常，則為造模成功。將成功造模的大鼠隨機分為曲馬多低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)劑量組、陽性對照組(吲哚美辛，7.5 mg/kg)和模型組，每組10只；另取10只大鼠作為假手術(shù)組，除制備髓核、暴露L5～6間孔外神經(jīng)不黏附髓核后，剩余操作與模型組一致。術(shù)后第3天，曲馬多各劑量組及吲哚美辛陽性對照組按10 ml/kg的容積灌胃給藥，以生理鹽水溶解稀釋成1.00、2.00、3.00 mg/ml曲馬多溶液和0.75 mg/ml吲哚美辛溶液，其劑量參照文獻〔9，10〕設(shè)置；模型組和假手術(shù)組給予等容積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。

1.4一般行為觀察、PWT及PWL檢測 各組大鼠均于末次給藥后24 h，觀察大鼠活動狀況后，參照文獻〔10〕采用觸覺測痛儀及熱輻射刺激儀測定各組大鼠PWT及PWL值。

1.5標本采取及血清疼痛標志物PGE2、SP水平檢測 將各組大鼠麻醉，取腹主動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，根據(jù)PGE2、SP ELISA試劑盒說明檢測上清液PGE2、SP水平。斷頭處死大鼠，迅速解剖出手術(shù)同側(cè)的L5段脊髓，于距L5脊髓髓核植入處前后約1.5 cm處割斷脊髓，取出約3 cm的脊髓組織，剪取0.5 cm凍存，其余組織立即于多聚甲醛(4%)固定24 h后備用。

1.6各組脊髓HE染色及星形膠質(zhì)細胞活化標志物GFAP免疫組化法檢測 將1.4固定的脊髓組織制備成5 μm厚的石蠟切片。依據(jù)HE試劑盒說明書對部分切片進行染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓組織病理變化。取剩余部分切片，脫蠟、水化及抗原修復(fù)后，與一抗抗體(GFAP，1∶500)室溫孵育過夜；添加羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下孵育2 h，加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，蘇木精溶液復(fù)染，然后透明、封片。在400倍光鏡下隨機取5個視野，應(yīng)用Image Pro Plus5.0系統(tǒng)進行半定量分析，結(jié)果表示為5個視野陽性表達的平均光密度值。

1.7Western印跡測定脊髓組織c-jun、c-fos、AP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2蛋白水平 將1.4中凍存的脊髓組織進行勻漿，離心后，取上清液，提取并測定蛋白濃度。取50 μg蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉(5%)于37℃封閉2 h，加入c-fos(1∶1 000)、c-jun(1∶1 000)、AP-1(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)、COX-2(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)一抗，4℃孵育過夜；加入羊抗兔或羊抗鼠二抗溶液(1∶1 000)，室溫孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯色后拍照，最后用Image-J軟件分析蛋白表達。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1曲馬多影響一般行為 假手術(shù)組活動正常；模型組飲食量及活動量降低，出現(xiàn)易激惹行為；曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組易激惹行為減少。

2.2曲馬多影響PWT、PWL 模型組與假手術(shù)組相比，PWT、PWL顯著降低(P<0.05)。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，PWT、PWL顯著升高(P<0.05)；曲馬多高劑量組與陽性對照組相比，PWT、PWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3曲馬多對血清疼痛指標的影響 與假手術(shù)組相比，模型組血清PGE2、SP水平顯著升高(P<0.05)。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，血清PGE2、SP水平顯著降低(P<0.05)；曲馬多高劑量組與陽性對照組相比，PGE2、SP水平差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組PWT、PWL、PGE2、SP、GFAP平均光密度值比較分，n=10)

2.4曲馬多對脊髓組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維整齊排列。模型組大鼠神經(jīng)纖維排列紊亂，軸突及髓鞘崩解，空泡變性較多。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠可見神經(jīng)纖維逐漸連續(xù)，軸突生長良好，且隨著曲馬多劑量升高上述損傷情況改善明顯。見圖1。

圖1 各組脊髓組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.5曲馬多對脊髓組織GFAP表達的影響 圖2中棕色表示GFAP陽性表達，即活化星形膠質(zhì)細胞。與假手術(shù)相比，模型組脊髓內(nèi)GFAP表達水平顯著升高(P<0.05)；曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，GFAP表達水平降低(P<0.05)，陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，GFAP表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.6曲馬多對脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達的影響 與假手術(shù)組相比，模型組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，曲馬多組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達均降低(P<0.05)；陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.7曲馬多影響脊髓內(nèi)炎癥因子蛋白表達 模型組與假手術(shù)組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達顯著升高(P<0.05)；曲馬多組與模型組相比，脊髓內(nèi)TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖4。

表2 各組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平

1～6：假手術(shù)組、模型組、曲馬多低劑量組、曲馬多中劑量組、曲馬多高劑量組、陽性對照組；圖4同圖3 各組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、 COX-2蛋白表達

圖4 各組脊髓組織TNF-α、IL-1β蛋白表達

3 討論

坐骨神經(jīng)痛常見致病因素為腰椎間盤突出，且髓核突出并沖破椎間盤纖維環(huán)束縛，引起鄰近神經(jīng)根炎性免疫刺激，是腰椎間盤突出是坐骨神經(jīng)痛疼痛發(fā)生的主要機制之一〔11〕。于大鼠椎間孔外口植入髓核可模擬人體椎間盤突出引起的坐骨神經(jīng)痛，且創(chuàng)傷小、操作簡單、大鼠機械痛敏穩(wěn)定〔8〕。本研究結(jié)果提示大鼠出現(xiàn)疼痛癥狀，表明造模成功。研究證實炎癥是引起神經(jīng)損傷和神經(jīng)疼痛的重要原因〔2〕。羅強等〔12〕發(fā)現(xiàn)血清PGE2水平不僅能刺激椎間盤組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，還能增加組織對各種致痛因子的敏感度并刺激組織釋放SP等致痛因子，導(dǎo)致機體感覺神經(jīng)末梢產(chǎn)生并傳導(dǎo)疼痛。本研究提示，模型組大鼠出現(xiàn)炎癥因子、疼痛因子升高及脊髓損傷現(xiàn)象。曲馬多為新型阿片非麻醉性鎮(zhèn)痛藥，其鎮(zhèn)痛效果顯著，成癮性及不良反應(yīng)較小，已被臨床應(yīng)用于治療多種疼痛〔7〕。王宇飛等〔13〕發(fā)現(xiàn)曲馬多聯(lián)合普瑞巴林治療老年帶狀皰疹后神經(jīng)痛效果較好。本研究發(fā)現(xiàn)，曲馬多可緩解坐骨神經(jīng)痛大鼠疼痛癥狀，改善神經(jīng)炎性損傷，以高劑量最優(yōu)，但其改善坐骨神經(jīng)痛大鼠疼痛癥狀的具體分子機制還不明確。

鎮(zhèn)痛機制主要涉及抑制炎癥通路激活及星形膠質(zhì)細胞活化、促進神經(jīng)受損修復(fù)等，其中星形膠質(zhì)細胞活化與神經(jīng)疼痛機制的關(guān)系逐漸受到臨床研究的重視〔14〕。GFAP可作為星形膠質(zhì)細胞激活的重要標記物〔15〕。趙亮等〔16〕發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)痛模型大鼠中存在星形膠質(zhì)細胞活化即GFAP表達的升高。本研究提示，坐骨神經(jīng)痛大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細胞活化增加。近來研究發(fā)現(xiàn)“應(yīng)激性傳感器”c-fos可快速對外界刺激作出反應(yīng)，并通過亮氨酸拉鏈與c-jun結(jié)合成AP-1轉(zhuǎn)錄因子〔17〕，AP-1不僅可調(diào)節(jié)GFAP表達〔5〕，還可誘導(dǎo)炎癥因子釋放并促進神經(jīng)炎性損傷〔18〕。另外，星形膠質(zhì)細胞中c-fos蛋白也可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2等炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)大量表達〔19〕，其中COX-2可上調(diào)PGE2表達參與神經(jīng)炎性疼痛；NOS可促進NO彌散至細胞內(nèi)和細胞外引起痛覺過敏。另有研究顯示，IL-1β拮抗劑和COX-2抑制劑可減少疼痛標志物SP合成〔20〕。韓磊等〔8〕發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)iNOS及COX-2表達增高，提示坐骨神經(jīng)痛疼痛癥狀可能與iNOS/COX-2/PGE2/SP高表達有關(guān)。本研究推測神經(jīng)元受到病理刺激后，c-fos迅速感應(yīng)外界刺激，一方面與c-jun結(jié)合，形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，促進星形膠質(zhì)細胞活化并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β炎癥因子釋放而促進神經(jīng)炎癥損傷，另一方面誘導(dǎo)iNOS和COX-2表達并調(diào)控疼痛物質(zhì)PGE2或SP的釋放，使機體感覺神經(jīng)末梢產(chǎn)生并傳導(dǎo)疼痛，這可能是c-fos/c-jun參與星形膠質(zhì)細胞活化、炎癥損傷、疼痛傳導(dǎo)的主要機制。本研究提示，曲馬多可降低c-fos/c-jun通路相關(guān)蛋白表達，可能與減輕疼痛、神經(jīng)炎癥損傷及星形膠質(zhì)細胞活化有關(guān)，表明曲馬多可能通過抑制c-fos/c-jun通路激活，抑制星形膠質(zhì)細胞活化，緩解坐骨神經(jīng)痛模型大鼠神經(jīng)炎癥損傷及疼痛癥狀。

綜上，坐骨神經(jīng)痛可通過抑制c-fos/c-jun通路激活，抑制星形膠質(zhì)細胞活化，緩解坐骨神經(jīng)痛模型大鼠神經(jīng)炎癥損傷及疼痛癥狀，為臨床治療坐骨神經(jīng)痛和闡明曲馬多發(fā)揮鎮(zhèn)痛的可能生物學(xué)機制提供一定參考。但c-fos/c-jun通路靶向關(guān)系及分子調(diào)控作用與星形膠質(zhì)細胞活化的機制較復(fù)雜，可能涉及其他機制共同作用，有待后續(xù)研究。