下丘腦室旁核微量注射谷氨酸對心力衰竭大鼠心功能的影響及機(jī)制

李晶 劉羽承 郭雨欣 張波 趙津璋,3 辛恬 賈琳琳 于海波

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生理教研室，黑龍江 佳木斯 154000；2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3佳木斯市中心醫(yī)院；4佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)的神經(jīng)體液因素是心力衰竭(HF)進(jìn)程中重要的病理機(jī)制，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、多種炎性因子的過度表達(dá)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)功能失調(diào)等〔1〕。各種神經(jīng)體液因子的過度激活及相關(guān)神經(jīng)體液因素間的相互作用可進(jìn)一步加重鈉水潴留和交感神經(jīng)興奮性導(dǎo)致心功能惡化并形成惡性循環(huán)〔2〕。下丘腦室旁核(PVN)是調(diào)節(jié)體液平衡和心血管活動的重要核團(tuán)，可整合多層次神經(jīng)體液信號，是研究HF中樞機(jī)制的主要靶點(diǎn)。前期研究證實(shí) miR-132和谷氨酸(Glu)在HF大鼠下丘腦PVN表達(dá)上調(diào)〔3〕，為進(jìn)一步明確miR-132和Glu在HF大鼠下丘腦PVN的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過向HF大鼠下丘腦PVN微量注射Glu，灌流3 d后觀察其對心功能、HF標(biāo)志物血漿利鈉肽(BNP)、心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)和下丘腦PVN miR-132表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1模型制造 清潔級(SPF)成年雄性SD大鼠，動物許可號SCXK(黑)2019-001，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)動物置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食、水，適應(yīng)環(huán)境后3 d隨機(jī)分組為：假手術(shù)組(Sham)+人工腦脊液(ACSF)組、HF+ACSF組及HF+Glu組。腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/kg)，麻醉完成后實(shí)驗(yàn)動物四肢連接心電記錄電極，BL-420生物信號系統(tǒng)描記心電圖(ECG)，開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支上部復(fù)制HF疾病動物模型，結(jié)扎動脈后出現(xiàn)肉眼可見的心室壁舒縮活動減弱、心電ST段出現(xiàn)抬高判定動脈結(jié)扎成功。Sham組只進(jìn)行開胸處理，不結(jié)扎血管。逐層縫合關(guān)閉胸腔，術(shù)后青霉素8萬U肌肉注射連續(xù)3 d。各組實(shí)驗(yàn)動物結(jié)扎動脈4 w后均檢測心功能，檢測指標(biāo)中的左室舒張末壓力(LVEDP)≥15 mmHg認(rèn)為HF動物模型復(fù)制成功〔4〕。

1.2側(cè)腦室插管 實(shí)驗(yàn)動物麻醉狀態(tài)下進(jìn)行側(cè)腦室插管，應(yīng)用腦立體定位儀參照大鼠解剖圖譜及許艷艷等〔5〕的方法操作。HF+Glu組大鼠通過微量注射泵側(cè)腦室注入Glu濃度為200 μmol/L的ACSF 0.2 μl，其余兩組側(cè)腦室微灌注等量的ACSF，各組實(shí)驗(yàn)動物皆連續(xù)微量灌注3 d。

1.3主要藥品和試劑 L-Glu(G1251-500G)購自Sigma公司，BNP和CK-MB試劑盒購自碧云天生物科技公司。

1.4心功能檢測 完成Glu側(cè)腦室灌注3 d后，應(yīng)用BL-420生物信號系統(tǒng)和Aplio50東芝四維彩超由專業(yè)技師和臨床醫(yī)師在動物麻醉狀態(tài)下完成心功能檢測，操作步驟參考Cumberland等〔6〕的方法。

1.5標(biāo)本收集 實(shí)驗(yàn)動物清醒狀態(tài)下用肝素預(yù)先浸泡的細(xì)玻璃管刺入內(nèi)眥靜脈取血，離心后低溫冰箱保存?zhèn)溆茫槐ＷC實(shí)驗(yàn)動物在麻醉狀態(tài)下斷頭處死，快速打開胸腔、小心剪開心包膜游離心臟，冷生理鹽水沖洗，吸干水分后稱重，分離左心室心肌組織稱重后浸于固定液中保存用于組織學(xué)觀察；斷頭處死動物后快速取腦，參考大鼠解剖圖譜及王仁俊等〔7〕的方法確定下丘腦PVN位置，在冰塊上盡快取出PVN組織，低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6BNP和CK-MB含量檢測 血漿BNP水平檢測應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行；血漿CK-MB含量檢測應(yīng)用生化分析儀，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.7miR-132在下丘腦PVN的表達(dá) 用RT-PCR技術(shù)檢測各組大鼠下丘腦PVN miR-132的表達(dá)。下丘腦PVN組織切約100 mg薄片，裂解后離心靜置，遵循隨機(jī)選取的原則取10個(gè)樣本，從每個(gè)樣本中提取出2 μl液體，常規(guī)步驟檢測miR-132的表達(dá)，具體操作參考楊波等〔8〕的方法。

1.8計(jì)算心臟重量指數(shù)(HW/BW)和左心室重量指數(shù)(LVW/BW) 大鼠HW/BW為大鼠心臟重量和體重的比值，LVW/BW為左心室和體重的比值，是可用來評價(jià)心肌肥厚的指標(biāo)。

1.9組織學(xué)觀察 經(jīng)4%多聚甲醛固定的心臟組織標(biāo)本用石蠟包埋切片，經(jīng)烤片、脫蠟至水、蘇木素-伊紅(HE)染色、脫水封片等常規(guī)步驟后光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1心功能和HW/BW、LVW/BW檢測結(jié)果 HF+Glu組和HF+ACSF組顯示出惡化的心功能和心肌肥厚，除心率(HR)外，HW/BW、LVW/BW、LVEDP、左室收縮壓(LVSP)、射血分?jǐn)?shù)(EF)與Sham+ACSF組相比差異顯著(P<0.05)；HF+Glu組HR與HF+ACSF組相比有顯著差異，其余檢測指標(biāo)與HF+ACSF組相比較差異無顯著意義(P>0.05)。見表1。

2.2血漿BNP和CK-MB含量檢測 HF+Glu組和HF+ACSF組血漿BNP和CK-MB含量較Sham+ACSF組明顯上調(diào)(P<0.05)；HF+Glu組血漿BNP和CK-MB含量較HF+ACSF組有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表2。

表1 各組心功能與HW/BW和LVW/BW檢測結(jié)果

表2 各組血漿BNP和CK-MB含量比較

2.3miR-132在下丘腦PVN的表達(dá) 與Sham+ACSF組(0.32±0.02)相比，HF+ACSF組、HF+Glu組下丘腦miR-132表達(dá)明顯升高(0.83±0.06、0.94±0.05，P<0.05)；與HF+ACSF組比較，HF+Glu組miR-132的表達(dá)雖有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 miR-132在3組下丘腦PVN中的表達(dá)

2.4光鏡下觀察各組大鼠心肌結(jié)構(gòu) Sham+ACSF組大鼠心肌結(jié)構(gòu)未見異常；HF大鼠出現(xiàn)心肌纖維變窄小，有纖維斷裂、空泡樣變性及脂肪變性出現(xiàn)；HF+Glu組和HF+ACSF組大鼠心肌結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的病理改變程度無顯著差異。見圖2。

圖2 光鏡下3組心臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)(×400)

3 討 論

miR-132是一種進(jìn)化保守、具有組織特異性的非編碼RNA,近年研究證實(shí)應(yīng)激狀態(tài)下miR-132在心臟組織中表達(dá)增多，可參與由血管緊張素(Ang)Ⅱ誘發(fā)的高血壓和心肌肥厚、可通過多條信號通路參與HF基因水平的異常調(diào)控〔9〕。CDR132L是首個(gè)miR-132類抑制劑，在相關(guān)動物和人體臨床研究中，CDR132L顯示出可緩解HF、甚至逆轉(zhuǎn)的良好藥效性，為此miR-132作為治療HF的潛在靶點(diǎn)而備受關(guān)注〔10,11〕。miR-132也在神經(jīng)組織中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)CNS的發(fā)育和功能，與多種疾病關(guān)系密切。Walgrave等〔12〕證實(shí)miR-132是小鼠和人類成年神經(jīng)發(fā)生的有效調(diào)節(jié)劑，阿爾茨海默病(AD)的病理改變可下調(diào)miR-132水平，而在一定范圍內(nèi)上調(diào)miR-132表達(dá)可促進(jìn)齒狀回神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，挽救AD小鼠的神經(jīng)發(fā)生和記憶缺陷，miR-132還可靶向作用膽堿酯酶調(diào)節(jié)大腦的免疫炎癥反應(yīng)及維持腦血管完整性等〔13,14〕。盡管miR-132在CNS中作用廣泛，但是否參與HF中樞機(jī)制尚不明確。

如前所述下丘腦PVN是調(diào)節(jié)體液和心血管活動穩(wěn)態(tài)的重要核團(tuán)，Glu是該核團(tuán)里重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。與主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)不同，PVN內(nèi)的Glu來源廣泛，既可來自下丘腦前核、海馬等其他核團(tuán)，也可來自自身大量的Glu能神經(jīng)元的釋放。miR-132與Glu的關(guān)系密切，如在海馬區(qū)miR-132對突觸可塑性的調(diào)控可通過激活相關(guān)的信號通路增加Glu受體陽性棘突的數(shù)量和提高微小興奮性突觸后電流頻率調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動來實(shí)現(xiàn)；而miR-132的表達(dá)也受Glu受體的狀態(tài)的影響〔15,16〕。此外有研究證實(shí)，在神經(jīng)疾病的不同階段，miR-132可在多種轉(zhuǎn)錄因子作用下向不同方向發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔17〕。

本研究提示，下丘腦PVN Glu可通過影響miR-132的表達(dá)加速心功能損害和HF進(jìn)程。還觀察到與HF+ACSF組相比較，HF動物下丘腦PVN微灌注Glu可進(jìn)一步加劇心功能損傷和上調(diào)血漿BNP、CK-MB含量，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是受Glu灌注時(shí)間和劑量的影響，受實(shí)驗(yàn)動物實(shí)時(shí)狀態(tài)和HF動物模型死亡率的影響，本實(shí)驗(yàn)對Glu的灌流只持續(xù)了3 d,今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對HF動物模型方法的改進(jìn)和下丘腦PVN Glu灌流劑量的摸索。