右美托咪定對(duì)腦出血患者神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

趙世軍 李銀宏 劉磊 霍保善

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，青海 西寧 810001；2佛山市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

腦出血是神經(jīng)外科的常見病，急性期進(jìn)行血腫清除術(shù)有重要意義，但是血腫清除后可繼發(fā)再灌注的損傷，同時(shí)由于殘留血腫對(duì)細(xì)胞的毒性作用及機(jī)體強(qiáng)烈的應(yīng)激性因素均可以引起繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷〔1〕。右美托咪定(DEX)是近年應(yīng)用于臨床的新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗交感等作用〔2〕。近年發(fā)現(xiàn)右美托咪定在麻醉誘導(dǎo)期應(yīng)用，對(duì)術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)平衡有一定的調(diào)控作用，對(duì)術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復(fù)有一定價(jià)值〔3〕。基于此本研究應(yīng)用前瞻性研究，構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞的損傷模型，同時(shí)收集腦出血手術(shù)患者，應(yīng)用右美托咪定進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，探討其意義。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。培養(yǎng)方法：置于37℃、95%濃度的O2、5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中孵育，應(yīng)用的培養(yǎng)液為含90%的DMEM、10%的胎牛血清及100 U/ml的青霉素和100 mg/ml鏈霉素，細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)前接種，密度為5 000個(gè)/cm2。建立對(duì)照組(C組)、實(shí)驗(yàn)組(FeCl2組)和右美托咪定組(FeCl2+DEX組)。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)選擇100 μmol/L的FeCl2的濃度構(gòu)建損傷的細(xì)胞模型〔1〕。DEX選擇20 μmol/L最理想的濃度。

1.2臨床資料及麻醉方法 選擇2018年5月至2019年6月確診為腦出血并行手術(shù)治療的76例患者，按入院順序進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腦出血急性期行全麻下血腫清除術(shù)；②美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASA)≤Ⅳ級(jí)，Glasgow評(píng)分≥5分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他器官嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；②有精神疾病史；③合并蛛網(wǎng)膜下腔出血者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)中出血量超過1 500 ml；②術(shù)后出血行二次手術(shù)者。患者或家屬均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

麻醉方法：患者入室后行氣管插管，觀察生命體征平穩(wěn)后，觀察組應(yīng)用0.5 μg/(kg·h)持續(xù)輸注DEX至術(shù)畢，對(duì)照組輸注等量生理鹽水。面罩預(yù)充氧3 min后，丙泊酚TCI初始靶濃度3 μg/ml，待效應(yīng)室濃度平衡。靜脈注射苯磺酸順式阿曲庫銨，靶控輸注瑞芬太尼后，經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管，調(diào)節(jié)通氣，監(jiān)測(cè)血氧及中心靜脈壓。調(diào)節(jié)麻醉藥的血漿靶濃度，持續(xù)泵注順式阿曲庫銨至術(shù)畢，關(guān)閉硬腦膜前靜注芬太尼20 μg，術(shù)畢前30 min靜注氟比洛芬酯，術(shù)后注意鎮(zhèn)痛，并應(yīng)用托烷司瓊。積極處理不良反應(yīng)及并發(fā)癥。

1.3方法

1.3.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在96孔板中，孵育過夜，每孔加100 μl培養(yǎng)液和10 μl CCK8試劑，避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.3.2miR-146a表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)miR-146a的表達(dá)。引物上游：5＇-GGGATGCGTGCGATTCCA-3＇，下游：5＇-CATGTGCGTCACGTGGATG-3＇，產(chǎn)物為98 bp。U6為內(nèi)參，上游：5＇-GCATAACACTAGAGGGTCCA-3＇，下游：5＇-CAGGTGAATTTCCCAGGTCGG-3＇，產(chǎn)物為75 bp。應(yīng)用TRIzol提取總RNA。cDNAs由TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。反應(yīng)程序：95℃ 10 min，循環(huán)1次；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min。60℃采集信號(hào)。記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因和相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3細(xì)胞系中BDNF、S100B和PCNA的檢測(cè) 內(nèi)參應(yīng)用GAPDH。BDNF、S100B和PCNA的試劑武漢博士德生物技術(shù)公司。制備分離膠后加樣，應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉，依次滴加一抗、二抗，顯影。行灰度分析，應(yīng)用Image J完成，以蛋白與GAPDH的比值的半定量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4血清中BDNF、S100B、超氧化物歧化酶(SOD)和miR-146a的檢測(cè) 檢測(cè)術(shù)前、術(shù)中、術(shù)畢、術(shù)后第1、2、3天患者血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表達(dá)。試劑盒均購自蘇州睿贏生物技術(shù)公司。BDNF、S100B的檢測(cè)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。SOD的檢測(cè)應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法。MiR-146a的檢測(cè)應(yīng)用qPCR法。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞系中細(xì)胞活力的比較 利用CCK-8試劑盒，檢測(cè)0～5 d細(xì)胞的活力。從第2天開始，F(xiàn)eCl2組細(xì)胞活性明顯低于C組，此種改變持續(xù)至第5天。而FeCl2+DEX組細(xì)胞活性明顯高于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能改善細(xì)胞的增殖作用。見表1。

表1 各組細(xì)胞系中細(xì)胞活力的比較(%，n=3)

2.2各組細(xì)胞系中miR-146a表達(dá)水平的比較 應(yīng)用qPCR法檢測(cè)第5天各組細(xì)胞中miR-146a表達(dá)，結(jié)果顯示FeCl2組miR-146a表達(dá)(0.98±0.09)明顯高于C組(0.65±0.08,P<0.05)，F(xiàn)eCl2+DEX組miR-146a表達(dá)(0.86±0.08)明顯低于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能下調(diào)miR-146a的表達(dá)。

2.3各組細(xì)胞系中BDNF、S100B和PCNA表達(dá)的比較 應(yīng)用Western印跡檢測(cè)第5天各組細(xì)胞系中BDNF、S100B和PCNA表達(dá)，結(jié)果顯示FeCl2組BDNF和PCNA表達(dá)明顯低于C組，S100B表達(dá)明顯高于C組，而FeCl2+DEX組BDNF和PCNA表達(dá)明顯高于FeCl2組，S100B表達(dá)明顯低于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能上調(diào)BDNF和PCNA的表達(dá)，下調(diào)S100B的表達(dá)。見圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞系中BDNF、S100B和PCNA表達(dá)的比較

表2 各組細(xì)胞系中BDNF、S100B和 PCNA表達(dá)比較

2.4腦出血患者基線資料 觀察組共38例患者，1例術(shù)中出血量超過1 500 ml提前終止干預(yù)；對(duì)照組共38例患者，1例術(shù)后顱內(nèi)出血行二次手術(shù)。均排除觀察。兩組各37例完成觀察及檢測(cè)。觀察組中男21例，女16例；年齡34～84歲，平均(59.6±7.5)歲；身高146～189 cm，平均(169.1±22.6)cm；體重40～102 kg，平均(69.7±19.7)kg。對(duì)照組中男19例，女18例；年齡35～83歲，平均(58.9±12.6)歲；身高149～187 cm，平均(168.9±32.1)cm；體重42～99 kg，平均(65.6±18.3)kg。兩組一般資料無明顯差異(P>0.05)。

2.5兩組譫妄發(fā)生率比較 術(shù)后第1、2天及術(shù)后3 d內(nèi)觀察組譫妄發(fā)生率明顯低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 兩組譫妄發(fā)生率比較〔n(%),n=37〕

2.6兩組各時(shí)點(diǎn) BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達(dá)比較 兩組術(shù)前血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；觀察組術(shù)中、術(shù)畢、術(shù)后第1、2天時(shí)BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表4。

表4 兩組各時(shí)點(diǎn)BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達(dá)比較

3 討 論

腦出血急性期神經(jīng)細(xì)胞伴有直接損傷和間接損傷。間接損傷主要為損傷因子誘發(fā)的。本實(shí)驗(yàn)選擇SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型，由于FeCl2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)〔4〕，且受損的神經(jīng)細(xì)胞與出血后的神經(jīng)細(xì)胞功能相似(均為鐵過載狀態(tài))，因此選擇FeCl2為損傷因子〔5〕。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FeCl2和DEX組的細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，且趨于正常細(xì)胞的活性，提示DEX能改善損傷神經(jīng)細(xì)胞的增殖能力，提高修復(fù)功能〔6〕，此種作用經(jīng)PCNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。有研究認(rèn)為DEX可以減少由Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因素也起到了不同程度的抑制〔7〕。BDNF是神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)因子，本研究提示DEX對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過介導(dǎo)BDNF上調(diào)實(shí)現(xiàn)的。研究顯示DEX調(diào)控時(shí)可引起下游核因子κB的活化，調(diào)節(jié)凋亡和炎癥反應(yīng)〔8，9〕。這個(gè)作用可能也是DEX對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的重要途徑之一。S100B是本實(shí)驗(yàn)選擇的神經(jīng)細(xì)胞損傷因子，是膠質(zhì)細(xì)胞的鈣結(jié)合蛋白，其在神經(jīng)細(xì)胞損傷后在神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞周圍及血清中均能檢測(cè)到其表達(dá)升高，這與神經(jīng)細(xì)胞的降解相關(guān)，也與神經(jīng)細(xì)胞的損傷后周圍炎性因子的刺激相關(guān)。S100B激活后氧自由基產(chǎn)生增多、興奮性氨基酸釋放過量、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷、凋亡基因激活、炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等均可以加重腦損傷。本實(shí)驗(yàn)顯示，DEX能使損傷的神經(jīng)細(xì)胞中S100B的表達(dá)下調(diào)，抑制神經(jīng)細(xì)胞周圍的液體環(huán)境，對(duì)正常內(nèi)環(huán)境細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡的恢復(fù)有重要價(jià)值。MiR-146a和SOD是氧化應(yīng)激指標(biāo)，SOD是保護(hù)因子，有研究顯示SOD可能是miR-146a的下游靶基因，二者可共同調(diào)控局部的應(yīng)激性反應(yīng)〔10〕。本研究證實(shí)了DEX對(duì)miR-146a的下調(diào)作用及對(duì)SOD的上調(diào)作用，使神經(jīng)細(xì)胞損傷程度減弱，應(yīng)激反應(yīng)減弱〔11，12〕。也有研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)與局部神經(jīng)細(xì)胞損傷后鐵蛋白增高有關(guān)〔13，14〕。本研究雖然未顯示出二者靶的靶向關(guān)系，但是DEX對(duì)二者均有調(diào)控也間接證實(shí)了二者的協(xié)同性。DEX使機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)控制在一定的水平。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系干預(yù)中DEX對(duì)miR-146a進(jìn)行調(diào)控，但是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的鐵無明顯作用，使本研究結(jié)果更客觀。

本實(shí)驗(yàn)表明，腦出血患者術(shù)中應(yīng)用DEX可以減少應(yīng)激反應(yīng)，提高血清中神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)因子的表達(dá)。DEX可以引起術(shù)后患者譫妄發(fā)生率明顯下降，這與DEX應(yīng)用后減輕腦水腫，改善神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分，抑制炎癥反應(yīng)均有關(guān)。DEX在術(shù)中應(yīng)用是安全的，也有研究顯示DEX可以抑制炎癥因子的升高〔15，16〕。DEX應(yīng)用后血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表達(dá)有趨勢(shì)性改變，這與細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果較為一致。DEX的藥理作用是抑制藍(lán)斑核去甲腎上腺素釋放和神經(jīng)元細(xì)胞膜的超級(jí)化，通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性減少環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的生成〔17，18〕。DEX的藥理作用是改善不完全損傷神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，通過ERK通路刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生BDNF，降低S100B蛋白的表達(dá)，同時(shí)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡〔19，20〕。DEX減弱患者術(shù)中和術(shù)后的應(yīng)激損傷〔21，22〕。這種作用與DEX能降低血漿中兒茶酚胺的濃度、抑制交感神經(jīng)興奮可能有關(guān)〔23〕。

綜上，DEX能發(fā)揮腦出血神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)功能，降低氧化應(yīng)激水平。腦出血患者應(yīng)用DEX后譫妄發(fā)生率低，血清學(xué)指標(biāo)趨勢(shì)于穩(wěn)定，臨床中可以積極應(yīng)用。