十八叔胺修飾硅膠色譜固定相制備及分離性能研究

車軒，劉德祿，喬曉強(qiáng)

(1.河北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，河北 石家莊 050000；2.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

生物膜是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能的關(guān)鍵元素.自1972年辛格和尼克森首次報(bào)道了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的流體鑲嵌模型后，人們對細(xì)胞膜及其各組成部分的作用研究更加深入[1].生物膜中膜脂和膜蛋白質(zhì)種類繁多，其中膜脂約占細(xì)胞膜質(zhì)量的50%，主要類型包括磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰絲氨酸(PS)等[2-3].同時，磷脂分子還具有多種多樣的異構(gòu)體，如sn位置同分異構(gòu)體、雙鍵位置異構(gòu)體、雙鍵順反同分異構(gòu)體、R/S手性對映體等，這進(jìn)一步增加了磷脂分離分析的挑戰(zhàn)性[4].

早期的磷脂分析方法常采用絡(luò)合光度法和比色法對磷脂總量進(jìn)行檢測和質(zhì)量分析，該方法的缺點(diǎn)在于不能實(shí)現(xiàn)單一組分的分析檢測[5-6].之后，薄層色譜法被開發(fā)用于磷脂的分離分析，具有操作簡便和樣品處理量大等優(yōu)點(diǎn)，一直被沿用至今.薄層色譜法主要缺點(diǎn)是其僅對同一類別的磷脂具有分離效果，無法對單一類別中磷脂分子種屬進(jìn)行分離分析.此外，薄層色譜分析過程中待分析磷脂分子會完全暴露于空氣中，導(dǎo)致部分不飽和脂肪酸氧化，使結(jié)果產(chǎn)生偏差[7].高效液相色譜是近年來廣泛采用的磷脂分離分析技術(shù).在磷脂分離過程中，不同的色譜模式可扮演不同的作用.不同類別的磷脂分子多采用正相色譜(NPLC)進(jìn)行分離；對于同一類不同種屬的磷脂往往采用反相色譜(RPLC)進(jìn)行分離[8-9].近年來，混合模式色譜受到廣泛關(guān)注，其具有分離選擇性高、負(fù)載能力強(qiáng)、分離效率高等優(yōu)點(diǎn).通過在同一根色譜柱上設(shè)計(jì)多種分離模式，可在不同模式下完成多種類型和結(jié)構(gòu)磷脂的高效分離分析[10-11].因此，研究新型混合模式色譜固定相可為磷脂的高效分離提供新的途徑.

本文采用含有環(huán)氧基團(tuán)的硅烷化試劑對球形多孔硅膠進(jìn)行硅烷偶聯(lián)反應(yīng)，再利用十八叔胺(DMOA)結(jié)構(gòu)中的叔胺對環(huán)氧基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，制備了十八叔胺極性嵌合色譜固定相(SiO2-DMOA)，探討了填充SiO2-DMOA色譜柱的保留機(jī)制、分離性能和分離選擇性，進(jìn)一步將其應(yīng)用于大豆卵磷脂和肺腺癌細(xì)胞磷脂的分離分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配備有ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測系統(tǒng)(美國奧泰科技有限公司)的P230II高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；Milli-Q純化系統(tǒng)(法國Millipore公司)；STA449C熱重分析儀(德國耐馳公司)；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；高速離心機(jī)(河北標(biāo)普科學(xué)器材有限公司).

球形多孔硅膠粒徑5 μm，孔徑12 nm,購自日本Daisogel公司；3-縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)、蒽、三亞苯、鄰苯二胺、對乙酰氨基酚(北京伊諾凱科技有限公司)；DMOA(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司)；對氨基苯甲酰胺、煙酰胺、2-碘乙酰胺(阿法埃莎試劑有限公司)；丁苯、乙苯、苯、丙苯(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所有限公司)；苯甲腈、2-苯乙醇、苯甲醚、萘、對甲苯酚、4-叔丁基苯酚、對氯苯酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；2,6-二甲基苯胺、苯胺(上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)；三氯甲烷、甲苯、正己烷、環(huán)己醇、三乙胺(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；大豆卵磷脂(威海恩威萬生物科技有限公司)；冰乙酸、三乙胺、異丙醇、色譜正己烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)(美國Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司)；二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)(北京百靈威科技有限公司)；色譜純乙腈(ACN)、甲醇(天津賽孚瑞科技有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SiO2-DMOA色譜固定相的制備

SiO2-DMOA固定相的制備分為環(huán)氧基修飾二氧化硅(SiO2-GPTMS)的制備和SiO2-DMOA的制備(圖1).

圖1 SiO2-DMOA固定相制備示意

SiO2-GPTMS制備：首先稱取2.4 g干燥過夜的球形硅膠置于250 mL圓底燒瓶中，依次加入30 mL無水甲苯、2.4 mL GPTMS和300 μL三乙胺重懸，反應(yīng)體系搖勻后，N2氛圍下95 ℃加熱回流24 h.待反應(yīng)完畢后，用甲苯、乙腈和甲醇依次洗滌2遍以洗去雜質(zhì)，抽提后置于80 ℃烘箱中干燥過夜，獲得SiO2-GPTMS.

SiO2-DMOA制備：稱取2.4 g SiO2-GPTMS置于250 mL圓底燒瓶中，依次加入30 mL的甲醇和12 mL的DMOA重懸，充分混勻，N2氛圍下50 ℃加熱回流2 h.反應(yīng)結(jié)束后，用大量甲醇洗去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，置于80 ℃烘箱中烘干24 h，獲得SiO2-DMOA固定相.

1.2.2 色譜柱的填充

SiO2-DMOA色譜柱采用高壓勻漿法填裝.稱取2.0 g的SiO2-DMOA固定相置于100 mL燒杯中，將SiO2-DMOA色譜固定相與勻漿液混合，超聲處理2 s使其均勻分散，勻漿液按照氯仿-環(huán)己醇體積比為3∶7進(jìn)行配置.將150 mm× 4.6 mm的空柱管與勻漿罐連接好，并將混懸液倒入勻漿罐中.調(diào)節(jié)壓力使其上升至35 MPa，加壓液甲醇-異丙醇(體積比為1∶1)會隨著管路流過勻漿罐下方的色譜柱，在此壓力下維持30 min，緩慢降低壓力，靜置30 min.將柱管卸下后裝好篩板和柱頭，隨后用乙腈沖洗色譜柱，待使用.

1.2.3 色譜分離條件

SiO2-DMOA色譜柱的性能評價采用P230II高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行.小分子物質(zhì)采用UV230Ⅱ紫外檢測器，在柱溫28 ℃條件下以乙腈-水為流動相，1.0 mL/min的流速等度洗脫進(jìn)行測試，進(jìn)樣量為5 μL.多環(huán)芳烴類和苯酚類物質(zhì)檢測波長選用254 nm，烷基苯類、苯衍生物類、苯胺類和酰胺類物質(zhì)紫外檢測波長選用214 nm.磷脂樣品的檢測采用ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測器，色譜流速為1.0 mL/min，檢測器漂移管溫度為100 ℃，氣體流速為2.0 L/min，進(jìn)樣量為10 μL.

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

所有小分子物質(zhì)均采用乙腈或水溶解、過膜、冷藏備用，苯酚類、酰胺類、苯胺類和苯衍生物類樣品質(zhì)量濃度控制在60～100 μg/mL；烷基苯類和多環(huán)芳烴類物質(zhì)質(zhì)量濃度控制在200～300 μg/mL.DMPC、DPPC和DSPC均采用三氯甲烷-甲醇(體積比為1∶1)配制，DPPG和DPPE采用三氯甲烷-甲醇(體積比為3∶1)配制，質(zhì)量濃度控制在0.4～0.8 mg/mL.

1.2.5 實(shí)際樣品的制備

對于大豆卵磷脂樣品，首先去除膠囊.將100 mg大豆卵磷脂樣品用10 mL正己烷-異丙醇(體積比為1∶1)稀釋溶解，樣品在4 ℃下超聲10 min，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，以備后續(xù)使用[12].肺腺癌細(xì)胞(由河北大學(xué)附屬醫(yī)院提供)膜脂的提取方法參照Folch法[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 SiO2-DMOA固定相表征

首先，SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行表征.圖2a為SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相在4 000～400 cm-1內(nèi)的紅外光譜圖.圖2a中可以明顯看到在SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA的紅外譜圖中1 100 cm-1處的強(qiáng)吸收峰，SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA是以二氧化硅為基底材料，所以此處峰可以認(rèn)定為由Si—O的伸縮振動所引起.相比于SiO2-GPTMS，可以在SiO2-DMOA固定相中觀察到2 930 cm-1和2 850 cm-12處吸收峰，這屬于DMOA結(jié)構(gòu)中典型的甲基和亞甲基的特征峰.

此外，對SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA固定相進(jìn)行熱重分析.如圖2b所示，在溫度上升至800 ℃時，SiO2幾乎沒有質(zhì)量損失.SiO2-GPTMS在400 ℃質(zhì)量損失加劇，可以歸于SiO2-GPTMS表面鍵合硅烷化試劑損失導(dǎo)致.SiO2-DMOA色譜固定相大約在170 ℃開始第1次發(fā)生質(zhì)量損失，這可能是SiO2-DMOA色譜固定相表面最外層鍵合的DMOA損失導(dǎo)致的，SiO2-DMOA色譜固定相在400 ℃開始第2次質(zhì)量損失，這與SiO2-GPTMS的質(zhì)量損失相似.在800 ℃時，與SiO2相比，SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA質(zhì)量分別損失了13.5%和17.0%.上述結(jié)果可證明SiO2-DMOA固定相已成功制備.

圖2 SiO2、SiO2-GPTMS和SiO2-DMOA的紅外(a)和熱重(b)分析

2.2 保留機(jī)制

首先選取甲苯、乙苯、丙苯、丁苯對SiO2-DMOA色譜柱的保留機(jī)制進(jìn)行考察.從圖3a可以看出，當(dāng)洗脫液中ACN體積分?jǐn)?shù)從40%增加到90%時，4種烷基苯類物質(zhì)的保留呈下降趨勢，保留因子從7.83下降到0.05，表現(xiàn)出典型的反相色譜保留機(jī)制.此外，SiO2-DMOA固定相表面存在季胺基團(tuán)，因此SiO2-DMOA色譜柱可能存在親水保留機(jī)制.進(jìn)一步選取2-碘乙酰胺、對氨基苯甲酰胺和煙酰胺考察了SiO2-DMOA色譜柱的保留機(jī)制.如圖3b所示，隨著洗脫液中H2O體積分?jǐn)?shù)從1%增加到40%，2-碘乙酰胺、對氨基苯甲酰胺和煙酰胺的保留逐漸下降，表現(xiàn)出典型的親水色譜保留機(jī)制.因此，SiO2-DMOA色譜柱具有反相/親水混合模式保留機(jī)制.

流動相：乙腈-水；檢測波長：214 nm；流速：1.0 mL/min

2.3 SiO2-DMOA色譜柱分離性能

由于SiO2-DMOA色譜柱具有親水和反相混合模式保留機(jī)制，選取親水性酰胺類物質(zhì)考察了SiO2-DMOA色譜柱在親水模式下的分離性能；選取疏水性苯胺類、烷基苯類、苯衍生物類、苯酚類和多環(huán)芳烴類物質(zhì)探究了SiO2-DMOA色譜柱在反相模式下的分離性能.

首先考察了SiO2-DMOA色譜柱對酰胺類和苯胺類物質(zhì)的分離選擇性.圖4a為2-碘乙酰胺、對氨基苯甲酰胺和煙酰胺的色譜分離圖.以乙腈-水(體積比為99∶1)進(jìn)行洗脫，3種物質(zhì)可在4 min內(nèi)達(dá)到基線分離，分離度分別為2.35和2.44，且具有良好的峰形，拖尾因子為0.97～1.09.2-碘乙酰胺、對氨基苯甲酰胺和煙酰胺的理論塔板數(shù)分別為72 000、71 200和64 400 N/m.苯胺、鄰苯二胺和2,6-二甲基苯胺3種堿性的苯胺類物質(zhì)色譜分離結(jié)果如圖4b所示，3種物質(zhì)在3 min內(nèi)可達(dá)到基線分離，其中鄰苯二胺的理論塔板數(shù)可達(dá)77 100 N/m.

流動相：a.乙腈-水(體積比為99∶1)；b.乙腈-水(體積比為56∶44)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm

進(jìn)一步選用烷基苯和苯衍生物類物質(zhì)考察了其分離選擇性.對于烷基苯類物質(zhì)，如圖5a所示，甲苯、乙苯、丙苯和丁苯在SiO2-DMOA色譜柱中的保留隨著疏水性增強(qiáng)而增加，4種化合物在6 min內(nèi)能夠分離，理論塔板數(shù)依次為66 700、70 600、72 800、76 600 N/m，其分離度依次為2.93、4.01和4.63.如圖5b所示，以ACN-H2O(體積比為55∶45)作為洗脫液，在4 min內(nèi)3種苯衍生物可實(shí)現(xiàn)基線分離，其出峰依次為2-苯乙醇、苯甲腈和苯甲醚，分離度分別為2.9和2.55，拖尾因子依次為1.0、0.96和0.94，理論塔板數(shù)均在65 000 N/m以上.

流動相：a.乙腈-水(體積比為60∶40)；b.乙腈-水(體積比為55∶45)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm

最后，選取苯酚類和多環(huán)芳烴類物質(zhì)考察了SiO2-DMOA色譜柱的分離性能.如圖6a所示，以ACN-H2O(體積比為70∶30)作為洗脫液，4種苯酚類物質(zhì)在4 min內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)分離，出峰順序依次為對乙酰氨基酚、對甲酚、對氯苯酚和4-叔辛基苯酚，分離度均在3.57以上，最高理論塔板數(shù)可達(dá)74 700 N/m.3種多環(huán)芳烴，萘、蒽和三亞苯的分離結(jié)果如圖6b所示，上述物質(zhì)可以在5 min內(nèi)達(dá)到基線分離且峰形良好，拖尾因子為0.88～0.95，分離度均在5.6以上，最高理論塔板數(shù)為81 100 N/m.

流動相：a.乙腈-水(體積比為70∶30)；b.乙腈-水(體積比為78∶22)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm

2.4 SiO2-DMOA色譜柱用于磷脂分離分析

不同類別磷脂結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)為頭部基團(tuán)極性的差異，在分離時主要采用正相色譜模式.基于SiO2-DMOA色譜柱具有反相/親水混合模式保留特性，首先采用不同類別的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品考察了SiO2-DMOA色譜柱對混磷脂樣品的分離選擇性.如圖7a所示，以具有相同烷基側(cè)鏈的磷脂DPPG、DPPE和DPPC為樣品，能夠在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，其出峰順序依次為DPPG、DPPE和DPPC.

進(jìn)一步將SiO2-DMOA色譜柱應(yīng)用于不同?；鶄?cè)鏈長度PC種類的分離.如圖7b所示，以甲醇-乙腈(體積比為40∶60)為洗脫液，DMPC、DPPC和DSPC在17 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，且峰形良好，并沒有明顯拖尾現(xiàn)象.DMPC、DPPC和DSPC的差異主要表現(xiàn)為2條?；鶄?cè)鏈含碳數(shù)目的不同，其尾部含碳數(shù)目分別為13、15和17.因此3種PC在SiO2-DMOA色譜柱上的洗脫順序依次為DMPC、DPPC和DSPC.

流動相:a.A-甲醇(體積比為50∶50)，其中A相為異丙醇-水-正己烷-冰乙酸-三乙胺(體積比為81∶14∶5∶1.5∶0.08)；b.甲醇-乙腈(體積比為40∶60)；流速：1.0 mL/min；ELSD檢測器

大豆卵磷脂是一種典型的植物提取磷脂，已經(jīng)被證實(shí)可以通過影響血管舒張和抑制一種參與調(diào)節(jié)血壓的關(guān)鍵酶來降低高血壓的風(fēng)險(xiǎn).此外，大豆卵磷脂還可以改善血糖和血脂，因此在營養(yǎng)補(bǔ)充劑市場上廣受歡迎.大豆卵磷脂是一種復(fù)合脂類樣品，主要由PC、PE和PI以及其他次要成分組成[14-15].快速高效的大豆卵磷脂分離檢測方法對大豆卵磷脂的質(zhì)量監(jiān)測和質(zhì)量控制尤為重要.進(jìn)一步采用大豆卵磷脂提取樣品考察了SiO2-DMOA色譜柱對復(fù)雜磷脂樣品的分離性能.圖8a為以A-甲醇(體積比為50∶50)為流動相的色譜分離圖，從圖8a中可以看到，在12 min內(nèi)共可以觀察到10個色譜峰，顯示了良好的分離性能.

流動相:A-甲醇(體積比為50∶50)，其中A相為異丙醇-水-正己烷-冰乙酸-三乙胺(體積比為81∶14∶5∶1.5∶0.08)；流速：1.0 mL/min；ELSD 檢測

隨著社會的發(fā)展，吸煙越來越年輕化，首次吸煙的年齡也在逐漸縮小.肺癌是目前病死率最高的惡性腫瘤之一，而肺腺癌是最常見的肺癌類型之一.值得一提的是在肺癌發(fā)病率研究中發(fā)現(xiàn)，不僅吸煙者的發(fā)病率高，吸二手煙患者的發(fā)病率也在逐年增高[16-17].基于SiO2-DMOA色譜柱對磷脂良好的分離效果，進(jìn)一步將SiO2-DMOA色譜柱用于提取的肺腺癌細(xì)胞膜中磷脂組分的分離分析.如圖8b所示，肺腺癌細(xì)胞膜磷脂提取物在12 min內(nèi)大致可觀察到11個色譜峰.上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SiO2-DMOA色譜柱對復(fù)雜磷脂樣品具有良好的分離選擇性.

3 結(jié)論

以十八叔胺DMOA為功能單體，利用環(huán)氧-叔胺親核開環(huán)反應(yīng)，制備了極性嵌合的SiO2-DMOA色譜固定相.填充SiO2-DMOA色譜柱顯示了典型的反相/親水混合模式保留特征，并可實(shí)現(xiàn)親水性酰胺類和疏水性烷基苯類等物質(zhì)的高效分離分析，其最高柱效可達(dá)81 100 N/m.該色譜柱也可實(shí)現(xiàn)不同磷脂類別和種類的分離，并可有效分離大豆卵磷脂和肺腺癌細(xì)胞中的磷脂組分，在磷脂分析中具有良好的分離潛力.