外源EBR對低溫脅迫下火龍果苗抗氧化系統(tǒng)及脂肪酸不飽和度的影響

王楚僑，羅 斕，羅 弦*，賈永霞，黃一梅

1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，四川成都 611130

火龍果（Hylocereus undatus）原產(chǎn)于墨西哥南部及中美洲太平洋沿岸地區(qū)，為仙人掌科量天尺屬的多年生肉質(zhì)藤蔓型果樹[1]，其果實含有一般植物少有的植物白蛋白、花青苷以及豐富的礦物質(zhì)、糖類、水溶性膳食纖維等，具有獨特的風味和極高的營養(yǎng)價值[2]。近年來，火龍果栽培面積在我國海南、廣東、福建、廣西、貴州、云南、四川等地迅速擴大[3]。作為熱帶、亞熱帶果樹，火龍果最適生長溫度為25~35℃，低于5℃時可能會對其造成寒害，而廣西、云南、貴州、四川等地冬季的極端低溫天氣，溫度多在 0~5℃之間，易對火龍果植株造成低溫傷害[3-4]。

細胞膜作為植物細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)和能量交換的界面，最先感知低溫，也是低溫傷害的原發(fā)部位[5-6]。常溫下細胞膜為液晶相，而當?shù)蜏孛{迫達到一定程度時，細胞膜發(fā)生膜脂相變，由液晶相轉(zhuǎn)為凝膠相，失去流動性，此時的溫度為膜相變溫度[7]。脂肪酸作為細胞膜磷脂雙分子層的必要組分，其不飽和程度增加，膜相變溫度隨之降低，細胞膜流動性增強，低溫下細胞膜的完整性及其生物學功能更易維持[8-9]。而當細胞膜脂肪酸不飽和度較低時，膜相變溫度隨之升高，低溫下細胞膜的生理功能受阻，膜透性增大，電解質(zhì)外滲，活性氧（ROS）積累、丙二醛（MDA）含量及相對電導率（REC）增加，嚴重時會導致植株死亡[10-11]。因此，脂肪酸含量及不飽和程度與細胞穩(wěn)定性和抗寒性密切相關[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所采用的‘臺灣6號’紅心火龍果苗，購自成都市雙流區(qū)金橋鎮(zhèn)粵蓉火龍果基地（30°34′30″N，103°55′20″E），種植于四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)（30°42′30″N，103°51′32″E）。選擇生長良好、無病蟲害的火龍果植株扦插于直徑18 cm，高15 cm的花盆中，每盆1株，土壤配比為田園土∶通用型營養(yǎng)土=1∶1，土壤pH為6.69，有機質(zhì)為35.37 g/kg，堿解氮含量為143 mg/kg，有效磷為93 mg/kg，速效鉀為238 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗在四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)進行，當扦插苗成活后繼續(xù)培養(yǎng)2周，選取無病蟲害、長勢一致的植株，放入GZX-180F型光照培養(yǎng)箱中進行預培養(yǎng)（溫度為 30℃/20℃，12 h/12 h，培養(yǎng)箱光照強度為 8000 lx，相對濕度為50%）。3 d后進行以下處理：

（1）CK：常溫（30℃/20℃，12 h/12 h）噴施蒸餾水；

（2）CK+EBR：常溫（30℃/20℃，12 h/12 h）噴施0.5 mg/L EBR；

（3）LT：低溫（4℃/0℃，12 h/12 h）噴施蒸餾水；

（4）LT+EBR：低溫（4℃/0℃，12 h/12 h）噴施0.5 mg/L EBR。

常溫處理仍然放在 GZX-180F型光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，低溫處理的植株轉(zhuǎn)移至 DRXM-358C-3型人工氣候箱（氣候箱光照強度為 8000 lx，相對濕度為 50%），并逐漸降溫至 4℃/0℃。在處理第0、1、2 d對植株噴施EBR（0.5 mg/L為預實驗中確定的最佳濃度）和蒸餾水，一共 3次，每次在 4℃時間段噴施（每天早上進行，以全部莖稈濕潤即可）。處理7 d后觀察扦插苗寒害癥狀，計算寒害指數(shù)。取火龍果扦插苗莖稈頂部3 cm測定植株超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）含量、REC和 MDA含量、抗氧化酶活性、脂肪酸組分及含量，各處理重復3次，每個重復各5株。

包括頂板、梁、臨空墻、門框墻鋼筋的綁扎；枯板、底板、樓板與墻板的連接處，梁、板連接處；密閉門框的制作；鋼筋焊接、搭接要求；大體積混凝土等。

1.2.2 指標測定 （1）寒害指數(shù)。低溫脅迫7 d后，參照高國麗等[21]的方法統(tǒng)計植株的寒害指數(shù)（CI）。

設火龍果苗莖稈無寒害癥狀為0級；莖稈有1/3面積出現(xiàn)水漬狀斑點、黃化、萎焉等寒害癥狀為1級（輕度寒害）；莖稈有1/2面積出現(xiàn)寒害癥狀為2級（中度寒害）；莖稈有2/3面積出現(xiàn)寒害癥狀為3級（中重度寒害）；整個莖稈出現(xiàn)寒害癥狀為4級（重度寒害）。

寒害指數(shù)CI =（∑各寒害級數(shù)×該級別苗數(shù)）/（4×總苗數(shù)）

（2）活性氧和細胞膜穩(wěn)定性。O2-產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法[22]測定，H2O2含量采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[22]，REC采用電導率法[23]測定。

（3）抗氧化酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光化學還原法[22]測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[22]測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[22]測定，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用抗壞血酸氧化法[22]測定。

（4）脂肪酸含量。脂肪酸含量的測定參考ZHANG等[24]的方法進行。取0.2 g鮮樣用液氮研磨后轉(zhuǎn)至離心管中，加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸甲醇（含5%的2, 2-二甲氧基丙烷），同時加入100 μg十七烷酸（C17:0）標準品作為內(nèi)參。將離心管在80℃水浴加熱90 min，然后冷卻到室溫，依次加入1 mL 0.9%的NaCl和1.5 mL己烷后渦旋20 s，5000g離心5 min，將分層后的己烷層進行上機測試。采用安捷倫5890A氣相色譜儀進行測定分析，脂肪酸含量以該種脂肪酸占所測總脂肪酸含量的百分比表示。脂肪酸不飽和度（UFA/SFA）和雙鍵指數(shù)（DBI）的計算參考董春娟等[8]的公式：

UFA/SFA=不飽和脂肪酸相對含量/飽和脂肪酸相對含量

DBI=不飽和脂肪酸相對含量×雙鍵數(shù)/飽和脂肪酸相對含量

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 23.0軟件進行計算和統(tǒng)計分析，單因素方差分析（One-way ANOVA）、鄧肯（Duncan）進行差異顯著性（P＜0.05）檢驗，利用GraphPad Prism 8軟件繪圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗植株表型與寒害指數(shù)的影響

圖1為低溫脅迫下火龍果扦插苗的植株表型與寒害指數(shù)。由圖1可以看出，單純低溫處理7 d后植株頂部出現(xiàn)明顯黃化，植株整體表現(xiàn)出萎焉的癥狀，受寒害較為嚴重，寒害指數(shù)達 0.60。低溫下噴施 EBR可以減輕火龍果扦插苗的寒害癥狀，僅植株頂部出現(xiàn)些許水漬狀斑點以及輕微黃化，未表現(xiàn)出萎焉癥狀，受害較輕，寒害指數(shù)降低了0.35。而對照條件下噴施外源EBR，對火龍果植株表型及寒害指數(shù)無影響。說明低溫脅迫下噴施外源 EBR可以有效減輕火龍果扦插苗受到的低溫傷害。

圖1 外源EBR對火龍果扦插苗植株表型及寒害指數(shù)的影響Fig.1 Effect of exogenous EBR on plant phenotypes, cold injury rate and chilling injury rate

2.2 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗細胞膜穩(wěn)定性的影響

由圖2可以看出，常溫條件下，外源噴施EBR對火龍果扦插苗 MDA含量和 REC沒有顯著影響。而低溫脅迫會導致火龍果扦插苗 MDA含量和REC顯著升高，分別為對照的1.5倍和1.3倍。低溫脅迫下，外源噴施EBR的植株MDA含量和REC顯著降低，分別比單純低溫處理降低了14.3%和14.4%。

圖2 外源EBR對火龍果扦插苗MDA含量和REC的影響Fig.2 Effect of exogenous EBR on MDA content and REC in pitaya cutting seedlings

2.3 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗O2-產(chǎn)生速率、H2O2含量的影響

如圖3所示，與對照相比，EBR處理降低了火龍果扦插苗的H2O2含量，對O2-產(chǎn)生速率沒有顯著影響，說明常溫下噴施0.5 mg/L的EBR對火龍果扦插苗不會產(chǎn)生脅迫效應。低溫脅迫下，火龍果扦插苗 O2-產(chǎn)生速率和 H2O2含量顯著升高，分別為常溫對照的 1.5倍和 1.4倍；而低溫下外源噴施EBR可以顯著降低O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量，且相比于單純低溫處理分別降低了16.6%和20.3%。

圖3 外源EBR對火龍果扦插苗O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響Fig.3 Effect of exogenous EBR on O2- production rate and H2O2 content in pitaya cutting seedlings

2.4 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗抗氧化酶活性的影響

從圖4可以看出，低溫脅迫使SOD、POD、CAT活性顯著增強，與常溫對照相比分別增加了16.7%、73.3%和38.0%，對APX活性沒有顯著影響。而低溫下外源噴施EBR使SOD、POD、CAT活性進一步增強，與單純低溫處理相比分別升高了 13.2%、48.0%和33.3%，對APX活性無顯著影響。對照條件下外源噴施EBR使火龍果扦插苗POD活性增加，對SOD、CAT和APX活性均無顯著影響。

圖4 外源EBR對火龍果扦插苗抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of exogenous EBR on antioxidant enzymes activity in pitaya cutting seedlings

2.5 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗總脂肪酸含量的影響

如表1所示，常溫條件下外源噴施EBR對火龍果扦插苗總脂肪酸含量沒有顯著影響。低溫使火龍果苗總脂肪酸含量顯著升高；而低溫脅迫下，外源噴施 EBR對火龍果扦插苗的總脂肪酸含量無顯著影響。

表1 外源EBR對火龍果扦插苗總脂肪酸含量、脂肪酸不飽和度（UFA/SFA）和雙鍵指數(shù)（DBI）的影響Tab.1 Effect of exogenous EBR on total fatty acid content, fatty acid unsaturation (UFA/SFA) and double bond index (DBI) in pitaya cutting seedlings

2.6 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗脂肪酸組分的影響

由表2可以看出，在火龍果扦插苗中共檢測到 10種脂肪酸組分。常溫條件下噴施外源 EBR處理后，飽和脂肪酸組分C22:0相對含量升高為對照的 1.3倍，C16:0相對含量比對照降低了6.3%，不飽和脂肪酸C16:1相對含量比對照升高了 26.2%，其余脂肪酸組分未發(fā)生顯著變化。低溫處理使飽和脂肪酸C12:0、C16:0和C18:0的相對含量顯著增加，分別為常溫對照的1.3、1.1和1.2倍，而C20:0相對含量相比與常溫對照降低了34.9%；低溫脅迫下，不飽和脂肪酸C16:1、C18:1、C18:2的相對含量均顯著降低，相比于常溫對照分別降低了27.2%、15.3%和47.7%，其余脂肪酸組分無顯著差異。與單純低溫處理相比，低溫下噴施EBR使飽和脂肪酸C14:0、C16:0相對含量顯著降低，分別降低了7.8%和10.0%；不飽和脂肪酸C16:1、C18:2相對含量顯著升高，分別升高了 35.3%和 38.0%。低溫下噴施 EBR處理已使C16:1恢復至常溫對照水平，但 C18:2與常溫對照相比仍存在顯著差異。

表2 外源EBR對火龍果扦插苗脂肪酸組分的影響Tab.2 Effect of exogenous EBR on fatty acid compositions in pitaya cutting seedlings

2.7 EBR對低溫脅迫下火龍果扦插苗UFA/SFA和DBI的影響

如表1所示，低溫導致火龍果扦插苗UFA/SFA和DBI顯著降低，分別降低了32.1%和32.4%。與單純低溫處理相比，低溫下外源噴施EBR使火龍果扦插苗UFA/SFA和DBI顯著升高，分別增加了16.7%和16.9%，但仍低于常溫對照。常溫下外源噴施 EBR對火龍果扦插苗 UFA/SFA和DBI均未產(chǎn)生顯著影響。

3 討論

低溫作為一種常見的非生物脅迫，是影響火龍果生長發(fā)育和地域分布的主要環(huán)境因子之一。低溫條件下，植物細胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，REC升高；同時，膜脂過氧化作用加劇，而膜脂過氧化的最終產(chǎn)物是 MDA。因此 REC和 MDA可以在一定程度上反映植物的受損傷程度[5-6]。本研究中，通過人工模擬成都冬季的低溫4/0℃(12 h/12 h)7 d后，火龍果扦插苗的MDA含量和REC顯著升高，說明低溫脅迫打破了火龍果扦插苗細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，導致火龍果受到低溫傷害，出現(xiàn)黃化與萎焉的癥狀，寒害指數(shù)達 0.60，這與蘋果[25]和苜蓿[11]上的研究結果一致。EBR是廣泛存在于植物中的甾醇類植物激素，可促進植物蛋白質(zhì)的合成、提高酶活性，增強植物對環(huán)境脅迫的抵抗力[26]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下外源EBR可顯著降低棉花[19]、披堿草[27]的MDA含量和REC，減輕膜脂過氧化作用。與前人研究結果一致，本研究中，外源EBR處理顯著降低了火龍果扦插苗的MDA含量和REC，減輕了細胞膜受到的膜脂過氧化傷害，植株僅出現(xiàn)部分水漬狀斑點與輕微黃化，并未表現(xiàn)出萎焉的癥狀，寒害指數(shù)降低至0.25。表明EBR可以有效緩解低溫對火龍果扦插苗造成的傷害，提高其耐寒性。

低溫會破壞植物細胞 ROS平衡，導致 ROS過量積累，高濃度的ROS具有很強的氧化能力，使細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，進而影響細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，此時植物會啟動SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶，清除過量的ROS，緩解低溫傷害[28]。本研究中，低溫脅迫誘導火龍果扦插苗SOD、POD、CAT活性增強，表明植物體啟動了抗氧化系統(tǒng)，然而 O2-、H2O2含量仍顯著增加，說明低溫脅迫下抗氧化酶活性的增強并不能有效清除過量積累的ROS，使膜脂過氧化加劇，細胞膜上不飽和脂肪酸雙鍵斷裂[8]，細胞膜穩(wěn)定性遭到破壞，植株受到了低溫損傷。這與苜蓿[11]和甜瓜[29]上的研究結果一致。低溫下噴施外源EBR后，火龍果扦插苗的SOD、POD和CAT活性進一步增強，O2-、H2O2含量顯著降低。這可能是因為 EBR在逆境下可以增強防御基因如POD、CAT等的表達，或調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯進一步激活抗氧化酶系統(tǒng)[30]，從而誘導火龍果苗的抗氧化酶活性增加，有效清除了大量積累的 ROS，并因此減少了膜脂中不飽和脂肪酸雙鍵斷裂，使得膜脂過氧化程度有所緩解，細胞膜穩(wěn)定性及其功能得以維持[31]，減輕了低溫傷害，火龍果的耐寒性得到提高。類似的研究結果在葡萄[26]和黃瓜[18]中也得到證實。

低溫脅迫下植物細胞膜脂肪酸不飽和程度決定了膜脂的相變溫度，對于膜穩(wěn)定性和流動性至關重要，也是提高植物耐寒性的關鍵[5,32]。董春娟等[8]和曹寧等[9]在冷敏感植物黃瓜的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫顯著降低了黃瓜幼苗的UFA/SFA和DBI，影響了細胞膜穩(wěn)定性，使植株遭受了寒害。與前人的研究結果一致，本研究中，低溫下火龍果苗不飽和脂肪酸C16:1（棕櫚油酸）、C18:1（油酸）、C18:2（亞油酸）相對含量顯著降低，飽和脂肪酸C12:0（月桂酸）、C16:0（棕櫚酸）和C18:0（硬脂酸）含量顯著增加，UFA/SFA和DBI顯著降低，這是由于低溫下火龍果苗體內(nèi)過量積累的ROS攻擊了膜系統(tǒng)，使膜脂脂肪酸中的不飽和鍵被過氧化，導致膜脂流動性降低[33]，并形成了脂氫過氧化物[8]，最終轉(zhuǎn)化為MDA，對植株造成了傷害。而在抗寒性強的冬油菜[34]研究中則發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫在一定程度上提高了不飽和脂肪酸的比例和脂肪酸不飽和指數(shù)（IUFA），增強了細胞膜的穩(wěn)定性，這可能是因為物種不同、對低溫的耐受性不同所致。低溫下噴施EBR顯著提高了火龍果苗不飽和脂肪酸C16:1、C18:2的相對含量，降低了飽和脂肪酸 C14:0（肉豆蔻酸）、C16:0相對含量，UFA/SFA和DBI顯著提高，這可以歸因于2個方面。其一，EBR顯著提高了火龍果苗抗氧化酶活性，清除了過量積累的活性氧，使膜脂中烴碳-碳不飽和鍵的數(shù)量顯著增加，從而提高了脂肪酸不飽和度，有效緩解了ROS引起的膜脂過氧化作用，增強了細胞膜的流動性[35]。其二，低溫下EBR維持了脂肪酸去飽和酶活性、刺激了編碼脂肪酸代謝相關酶的基因表達，或直接改善膜脂的物理狀態(tài)[17,36]，從而增加了脂肪酸不飽和度。類似的研究結果在橄欖葉片[16]和高山離子芥懸浮細胞[17]中也得到證實。表明EBR可以通過提高脂肪酸不飽和度，保持低溫下細胞膜穩(wěn)定性及流動性，提高火龍果的抗寒能力。

4 結論

（1）低溫脅迫下火龍果苗的O2-和H2O2大量積累，使細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，降低了脂肪酸不飽和度，破壞了細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，導致電解質(zhì)外滲，火龍果苗受到寒害，出現(xiàn)大量水漬狀斑點。

（2）外源EBR可以增加火龍果苗的抗氧化酶活性，清除過量積累的ROS，提高細胞膜上不飽和脂肪酸相對含量以及脂肪酸不飽和指數(shù)，維持細胞膜的穩(wěn)定性，減輕膜脂過氧化程度，從而增強火龍果苗的耐寒性。