兒童抗結(jié)核藥物耐藥比例法、微孔板法、全基因組測(cè)序檢測(cè)對(duì)比研究

張 穎 任巧麗 趙瑞秋 許紅梅 龍曉茹

國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒童感染免疫重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染科（重慶 400014）

結(jié)核病仍是危害人類健康的感染性疾病[1]。據(jù)估計(jì)，2020年全球有990萬(wàn)人患有結(jié)核病，相當(dāng)于每10 萬(wàn)人口中有127 例，其中11.0%為兒童[2]。2009年至2015 年中國(guó)大陸31 個(gè)省份上報(bào)至國(guó)家疾病控制中心的肺結(jié)核中，0～14 歲兒童平均每年發(fā)病率為十萬(wàn)分之2.4，西部地區(qū)發(fā)病率最高[3]。兒童肺結(jié)核臨床表現(xiàn)不典型，病原學(xué)陽(yáng)性率低，易延誤診治[4]。雖然兒童耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）通常比成人有更好的治療效果（兒童治愈率78.0 %，成人為50.0 %），但不足5.0 %的兒童接受了適當(dāng)?shù)闹委焄5]。因此，盡早明確兒童感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐藥譜，選擇合適治療方案，提高治療成功率，有利于兒童結(jié)核病的防控。本研究對(duì)比比例法、微孔板法和全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）3 種方法用于異煙肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampicin，RFP）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和鏈霉素（streptomycin，SM）4種兒童常用抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)的檢驗(yàn)效能。

1 材料與方法

1.1 材料收集

選取2015 年10 月至2020 年9 月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染科化驗(yàn)室送檢標(biāo)本中分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的保存菌株87株，使用接種環(huán)接種到中性羅氏培養(yǎng)基上置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～8周，共復(fù)蘇成功61株。

調(diào)取對(duì)應(yīng)患兒的治療方案與治療結(jié)局，其中治療結(jié)局根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2021年最新的結(jié)核病的治療結(jié)局定義分為治療成功組和治療失敗或死亡組[6]。

1.2 方法

1.2.1 表型藥物敏感性試驗(yàn) 對(duì)所有成功復(fù)蘇菌株分別采用比例法和微孔板法（試劑盒均購(gòu)自珠海銀科生物科技有限公司）行表型藥物敏感性試驗(yàn)（drug susceptibility test，DST）及菌株鑒定。挑取羅氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的分枝桿菌菌落，移到含0.5 %吐溫80 的生理鹽水試管中，使用細(xì)菌超聲分散儀（購(gòu)自廣東體必康生物科技有限公司）分散菌落，配成1 mg/mL 的菌懸液。比例法DST：根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]，比濁后的菌懸液，在樣本稀釋瓶中利用含0.5 %吐溫80的生理鹽水，把菌懸液稀釋到10-2mg/mL 和10-4mg/mL。采用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取0.01 mL，將兩種濃度菌懸液分別接種到對(duì)照培養(yǎng)基及含藥的羅氏培養(yǎng)基表面。置于斜面處37 ℃培養(yǎng)，松開(kāi)蓋子，培養(yǎng)24～48 h 后，旋緊蓋子繼續(xù)培養(yǎng)4～6 周。當(dāng)對(duì)照中性羅氏培養(yǎng)基的菌體生長(zhǎng)良好后，比較含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計(jì)算耐藥百分比，耐藥百分比＞1 %報(bào)告耐藥，否則為敏感。含藥羅氏培養(yǎng)基的RFP 濃度為40 μg/mL，INH 為0.2 μg/mL，EMB 為2 μg/mL，SM 為4 μg/mL[7]。使用含0.005 mg/mL 的噻吩-2-羧酸肼（thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）和0.5mg/mL的對(duì)硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）進(jìn)行菌株鑒定，區(qū)分非結(jié)核分支桿菌和牛分枝桿菌。TCH 生長(zhǎng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分支桿菌，TCH 未生長(zhǎng)為牛分枝桿菌；PNB 生長(zhǎng)陽(yáng)性提示非結(jié)核分枝桿菌，PNB 未生長(zhǎng)提示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和牛分枝桿菌。微孔板法DST：按照產(chǎn)品使用操作說(shuō)明書(shū)，將無(wú)菌稀釋液全部加入凍干雜菌抑制劑混勻，使用移液器取100 μL加入米氏7H9液體培養(yǎng)基混勻后，取200 μL加入C1、D1陰性對(duì)照孔，180 μL分別加入A1、B1陽(yáng)性對(duì)照孔。100 μL濃度為1 mg/mL的菌懸液加入液體培養(yǎng)基中混勻，取200 μL 分別加入含濃度為0.2、0.4、0.8和1.6 μg/mL的含INH孔，0.25、0.5、1 和2 μg/mL 含RFP 孔，2.5、5、10 和20 μg/mL 的含EMB 孔，1、2、4 和8 μg/mL 的含SM 孔。另吸取20 μL 加入A 1 對(duì)照孔，制成1/10 陽(yáng)性對(duì)照孔，在A1中吸取20 μL加入B1孔，為1/100陽(yáng)性對(duì)照孔。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，在10～21 d 根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔菌落直徑情況進(jìn)行結(jié)果判讀。記錄最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）值，MIC 定義為與菌落生長(zhǎng)半徑小于1/10 陽(yáng)性對(duì)照孔的最低濃度。耐藥表示MIC 值大于臨界濃度，敏感為MIC 小于或等于臨界濃度。INH 的臨界濃度為0.2 μg/mL，RFP 為1 μg/mL，EMB 為5 μg/mL，SM為2 μg/mL[7]。

1.2.2 全基因組測(cè)序（WGS）用接種環(huán)從分離培養(yǎng)好的羅氏固體培養(yǎng)基上刮下綠豆大小的菌體，放入含500 μL TE緩沖液的離心管中，置80 ℃水浴30 min滅菌，干冰寄送至上海晶諾生物科技有限公司行基因組提取、質(zhì)控、建庫(kù)，使用Illumina 平臺(tái)行全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和H 37 Rv 標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，行變異位點(diǎn)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2或Fisher精確概率法檢驗(yàn)。以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算微孔板法和WGS對(duì)INH、RFP、EMB、SM耐藥預(yù)測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率及Kappa值；其中Kappa值0～0.2提示無(wú)一致性，0.21～0.39為具有較低的一致性，0.40～0.59 為一致性較弱，0.60～0.79為中等一致性，0.80～0.90為高度一致性，＞0.90 為幾乎完全一致[8]。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)鑒定，61株菌株均為MTB菌株。比例法DST結(jié)果中共有48株（78.7%）對(duì)4種藥物均敏感，13株（21.3%）對(duì)至少1 種藥物耐藥，對(duì)4 種藥物共同耐藥的3株（4.9%）；共有耐INH的11株（18.0%），耐RFP的7株（11.5%），耐EMB的5株（8.2%），耐SM的10株（16.4%），7株（11.5%）為多藥耐藥（MDR）。見(jiàn)圖1A。

微孔板法中，44株（72.1%）對(duì)4種藥物均敏感。2株（3.3%）EMB的MIC值為5.0 μg/mL，余59株為2.5 μg/mL，均為EMB 敏感菌株。46 株（75.4 %）INH 的MIC 值為0.2 μg/mL，4 株（6.6 %）為1.6 μg/mL，11 株（18.0 %）＞1.6 μg/mL，共計(jì)15株（24.6 %）為耐INH菌株。50株（82.0 %）RFP的MIC 值為0.3 μg/mL，4 株（6.6 %）為0.5 μg/mL，7 株（11.5 %）＞2.0 μg/mL 為耐RFP 菌株。52 株（85.2 %）SM的MIC值為1.0 μg/mL，1株（1.6 %）為4.0 μg/mL，2株（3.3%）為8.0 μg/mL，6株（9.8 %）＞8.0 μg/mL，共計(jì)耐SM 的菌株為9 株（14.7 %）。見(jiàn)圖1B。

圖1 比例法、微孔板法和WGS 鑒定61 株結(jié)核分枝桿菌耐藥結(jié)果分布

在WGS中，全敏感菌株46株（75.4 %），對(duì)4種藥物共同耐藥的4 株（6.6 %）；共有耐INH 的13 株（21.3 %），耐RFP的8株（13.1 %），耐EMB的6株（9.8 %），耐SM的9株（14.7 %），見(jiàn)圖1C。

2.2 三種方法耐藥結(jié)果一致性檢驗(yàn)

以比例法DST為金標(biāo)準(zhǔn)，微孔板法檢驗(yàn)INH耐藥性的敏感度、特異度和Kappa 值分別為100 %、92.0 %和0.81，RFP分別為85.7 %、98.2 %和0.84，EMB分別為0 %、10 0%和0.00，SM分別為80.0 %、98.0 %和0.81，符合率為91.8 %～96.7 %；WGS檢驗(yàn)INH 耐藥性的敏感度、特異度和Kappa 值分別為90.9 %、94.0 %和0.79，RFP的分別為100.0 %、98.2 %和0.92，EMB的分別為60.0 %、94.6 %和0.50，SM的分別為80.0 %、98.0 %和0.81，符合率為91.8 %～98.4 %。見(jiàn)表1。

表1 微孔板法和WGS對(duì)四種一線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)的診斷價(jià)值分析

2.3 抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在耐藥和敏感菌株間分布

比例法的11 株INH 耐藥菌株中，有1 株包含2個(gè)INH耐藥位點(diǎn)，fabG1-15C＞T和inhAIle194Thr。katG基因Ser 140 Asn 變異位點(diǎn)僅分布在ING 敏感的菌株，而Ser 315 Thr 在耐藥和敏感菌株中分別有9 和2 株，分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在15株MIC 值≥1.6 μg/mL 的菌株中，有13 株經(jīng)WGS發(fā)現(xiàn)耐INH相關(guān)基因變異，僅katGSer315Thr在兩種不同MIC 值菌株間的分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 INH耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

7 株經(jīng)比例法DST 鑒定為RFP 的耐藥菌株中，經(jīng)WGS 鑒定出的5 個(gè)rpoB基因中僅His 445 Leu 位于RFP 敏感菌株中，該位點(diǎn)在兩組間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在微孔板法MIC 值＞2.0 μg/mL的7株菌株中，共有分別存在rpoB基因Ser 450 Leu（n=4）、His 445 Asp（n=1）、His 445 Leu（n=1）和His445Tyr（n=1）4個(gè)不同的變異位點(diǎn)。而rpoBHis445Asn存在于MIC為0.5μg/mL的1株菌株中。僅Ser450Leu位點(diǎn)在不同MIC值的菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 RFP耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

在5株經(jīng)比例法鑒定為EMB耐藥的菌株中，有3 株分別包含embB基因Gln 497 Arg、Met 306 Ile 和Met 306 Val 位點(diǎn)，而在敏感菌株中有3 株分別包括Ala356Val、Gly406Ser和Met306Val位點(diǎn)，各位點(diǎn)的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。微孔板法中，2株MIC值為5.0 μg/mL的菌株均存在Met306Val位點(diǎn)，不同MIC 值菌株之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 EMB耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

在10 株經(jīng)比例法鑒定為SM 耐藥菌株的8 株分別存在rpsL基因Lys43Arg（n=6）和Lys88Arg（n=1）位點(diǎn)以及rrs基因514a＞c位點(diǎn)（n=1）；而在51株SM敏感菌株中，僅有1 株存在rpsL基因Lys 43 Arg 變異位點(diǎn)，該位點(diǎn)在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在8 株MIC ≥8 μg/mL 的菌株中，有rpsLLys43Arg（n=7）和rrs514a＞c（n=1）的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)。在1株MIC為4.0μg/mL的菌株中存在rpsLLys88Arg變異。rpsL基因Lys43Arg和Lys 88 Arg 變異位點(diǎn)在不同MIC 值菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 SM耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

2.4 治療結(jié)局與抗結(jié)核藥物的耐藥屬性相關(guān)性

菌株對(duì)應(yīng)61 例患兒均接受抗結(jié)核治療，其中6例（9.8%）治療失敗或死亡，其余55例（90.2%）治療成功。治療成功組和治療失敗或死亡組采用3 種方法鑒定出的4種抗結(jié)核藥物的耐藥屬性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。

表6 結(jié)核病患兒61例不同治療結(jié)局的菌株耐藥屬性分布[n (%)]

3 討論

目前，MTB耐藥性檢測(cè)仍以比例法和BACTEC分枝桿菌生長(zhǎng)指示管960 系統(tǒng)為金標(biāo)準(zhǔn)。而比例法DST 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4～8周，BECTEC儀器設(shè)備造價(jià)較高，且表型DST 由于生物安全問(wèn)題，均不適用于結(jié)核病發(fā)病率較低的發(fā)展中地區(qū)使用。微孔板法DST為改良的液體培養(yǎng)法，其操作便捷，觀察結(jié)果時(shí)間較短，并可明確藥物的MIC 值，已逐漸應(yīng)用于臨床。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，二代測(cè)序技術(shù)逐漸成熟且價(jià)格明顯降低，WGS 可用于MTB 的菌種鑒定、耐藥預(yù)測(cè)、異質(zhì)性耐藥及菌群傳播的研究[8]，已漸從科研走向臨床應(yīng)用。而本研究為WGS和微孔板法的兒童感染的MTB 耐藥性檢測(cè)的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究以比例法DST 為金標(biāo)準(zhǔn)，WGS 檢驗(yàn)對(duì)INH 和RFP 耐藥性診斷的敏感度和特異度處于90.9%～100%，與既往研究結(jié)果相近[9]。在一項(xiàng)總結(jié)了20項(xiàng)研究的綜述中，WGS對(duì)RFP耐藥性檢驗(yàn)的敏感度與特異度分別為98.0 %（95 %CI：93.0 %～98.0 %）和98.0 %（95 %CI：98.0 %～100.0 %），而INH 分別為97.0 %（95 %CI：94.0 %～99.0 %）和93.0 %（95 %CI：91.0 %～96.0 %）[9]。在近期同類研究中，與表型DST 相比，WGS 檢測(cè)RFP、INH、EMB 和SM 耐藥的敏感度與特異度分別為96.7 %和98.6 %、75.5 %和97.1 %、93.1 %和93.7 %、68.6 %和99.6 %[10]。除了EMB外，其余3種藥物的檢測(cè)結(jié)果與本研究均較為接近，提示W(wǎng)GS 對(duì)檢測(cè)INH、RFP和SM的耐藥性與比例法DST具有高度的一致性。

本研究的微孔板法檢驗(yàn)結(jié)果，除EMB外，INH、RFP和SM的敏感度與特異度處于80.0%～100.0%，與比例法DST 具有高度的一致性，與同類研究中RFP敏感度和特異度分別為97.1%、100.0%的結(jié)果較一致[11]。類似研究中的INH、RFP和SM的敏感度、特異度和Kappa 值分別為93.9%、98.8%和0.94，93.8%、99.6%和0.95，88.7%、100%和0.93[12]，與本研究結(jié)果相近。因此，微孔板法檢測(cè)RFP、INH和SM的耐藥性均與比例法具有高度一致性。

為探索3 種檢測(cè)耐藥方法存在差異的原因，本研究分析了4 種藥物耐藥相關(guān)基因變異位點(diǎn)在2 種表型DST 鑒定為敏感和耐藥的菌株中的分布差異。MDR-TB的出現(xiàn)是在INH耐藥的基礎(chǔ)上增加了RFP耐藥，因此更應(yīng)關(guān)注MTB的INH耐藥相關(guān)變異[13]。本研究中，比例法DST鑒定為INH敏感的菌株而在微孔板法或WGS 中鑒定為耐藥的菌株分別有4 株和3株，分別存在katG基因Ser315Thr和Ser140Asn變異位點(diǎn)。既往已證實(shí)katG基因Ser315Thr變異位點(diǎn)與INH 高水平耐藥相關(guān)[14]。在本研究中，包含該變異位點(diǎn)菌株INH 的MIC 值均≥1.6 μg/mL，再次證實(shí)該位點(diǎn)與INH耐藥相關(guān)。而含Ser140Asn變異位點(diǎn)的菌株MIC 值為1.6 μg/mL，且本研究中變異率較低，在比例法中鑒定為INH 敏感菌株。而在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)106 株耐INH 的菌株中僅有1 株存在katGSer140 Asn和Ala139Pro 共同變異[10]。因此，該位點(diǎn)是否與耐藥有關(guān)仍需更多研究驗(yàn)證。

雖然與其他抗結(jié)核藥物相比，RFP 耐藥相關(guān)基因變異不易出現(xiàn)，但由于RFP廣泛用于抗結(jié)核治療，耐藥率正逐年上升[15]。超過(guò)95.0%的RFP 耐藥相關(guān)變異集中在編碼RNA聚合酶的β亞單位的rpoB基因上[16]。多數(shù)存在于81 bp 的426～452 位（大腸桿菌編碼507～533位）氨基酸的RFP耐藥決定區(qū)域（rifampicin resistance determining region，RRDR），其中90.0%位于435、445 和450 位點(diǎn)，且均為RFP 高水平耐藥相關(guān)的基因變異位點(diǎn)[17]。本研究中耐RFP菌株的rpoB基因變異位點(diǎn)集中在445（50.0 %）和450（50.0 %）位點(diǎn)上，均處于RRDR，多數(shù)菌株的MIC值大于2.0 μg/mL，進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)與高水平RFP耐藥相關(guān)。相關(guān)研究使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)MDRTB時(shí)，發(fā)現(xiàn)耐RFP變異位點(diǎn)集中在445（16.7 %）和450（63.3 %）位點(diǎn)上，且替換氨基酸與本研究一致[16]。因此，考慮在本研究中3 種方法存在差異原因可能與本研究使用的為復(fù)蘇菌株，表型DST可能表現(xiàn)不穩(wěn)定有關(guān)。

隨著新型抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)，SM 已較少用于兒童結(jié)核病的治療。在既往研究中，存在rpsL基因Lys43Arg突變位點(diǎn)的MTB菌株SM的MIC值均大于32 μg/mL，考慮該位點(diǎn)與SM耐藥相關(guān)[18]。而本研究中，比例法鑒定為SM敏感而WGS鑒定為耐藥的1株MTB菌株中僅存在該耐藥位點(diǎn)，考慮可能與表型DST表現(xiàn)不穩(wěn)定有關(guān)。

本研究中，WGS 和微孔板法檢測(cè)EMB 耐藥性的結(jié)果與比例法DST 一致性較差，考慮與表型DST 中EMB 的錯(cuò)誤率較高有關(guān)。表型DST 是MTB耐藥性檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，該觀點(diǎn)會(huì)混淆耐藥基因突變位點(diǎn)的識(shí)別，尤其是EMB，據(jù)報(bào)道表型DST 中EMB耐藥性檢測(cè)的錯(cuò)誤率較高[19]。而本研究中，微孔板法中未鑒定出EMB 耐藥菌株，可能本研究使用耗材的EMB 的MIC 值低于WHO 的界定值。約50.0%～70.0%的EMB 耐藥的MTB 分離株存在embB基因306～497 位密碼子的基因變異[20]。已證實(shí)306、406 和497 位密碼子變異可導(dǎo)致低水平和中等水平的EMB耐藥[21]。在泰國(guó)的一項(xiàng)篩查EMB耐藥的MTB臨床分離株embB變異分布的研究中發(fā)現(xiàn)，306位密碼子存在氨基酸錯(cuò)義變異的概率為50.6%，其中含有Met306Val變異的菌株占44.1%[22]。本研究中，在3株經(jīng)比例法DST鑒定為EMB敏感而WGS耐藥的菌株中分別含有Met 306 Val、Gly 406 Ser 和Ala356Val變異位點(diǎn)。僅Ala356Val的功能不詳，在EMB耐藥菌株中的報(bào)道罕見(jiàn)，功能仍待驗(yàn)證。

本研究中菌株對(duì)應(yīng)的61例患兒治療結(jié)局與3種方法鑒定的耐藥和敏感菌株分布的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示治療結(jié)局與患兒感染的MTB對(duì)4種藥物是否耐藥無(wú)關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)與MDR-TB不良治療結(jié)局相關(guān)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素包括高水平莫西沙星耐藥、環(huán)絲氨酸耐藥、導(dǎo)致高水平氟喹諾酮耐藥性的變異和ethA變異，與EMB耐藥及相關(guān)基因變異無(wú)關(guān)[23]。但本研究結(jié)果也可能存在偏倚，與樣本量偏少，耐藥菌株比例偏小有關(guān)。

綜上所述，本次研究仍存在樣本量偏小，DST使用菌株為復(fù)蘇菌株而非臨床分離株等不足。本研究證實(shí)微孔板法和WGS 檢測(cè)INH、RFP 和SM 耐藥的效果與比例法DST 高度一致，可應(yīng)用于臨床。而EMB的耐藥性檢測(cè)可結(jié)合比例法DST和WGS結(jié)果綜合判斷。