青島地區(qū)6-丙酮酰四氫生物蝶呤缺乏癥患兒基因變異特點(diǎn)及隨訪分析

鐘瑤瑤 張立琴 杜 瑋 陸薇冰 劉婷廷

青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院（山東青島 266034）

高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia，HPA）是由于苯丙氨酸代謝途徑中酶缺陷所致的常染色隱性遺傳病，根據(jù)病因可分為苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）及其輔酶四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH 4）缺乏兩類[1]。BH 4 不僅是苯丙氨酸羥化酶的輔助因子，也是酪氨酸、色氨酸羥化酶的重要輔助因子，這兩種酶參與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成。BH 4 缺乏會導(dǎo)致不同程度的運(yùn)動障礙、肌張力異常、頑固抽搐、肢體震顫、智能落后等神經(jīng)癥狀[2]。參與BH 4 合成或再循環(huán)任一酶缺陷均會導(dǎo)致四氫生物蝶呤缺乏癥（tetrahydrobiopterin deficieney，BH4D）的發(fā)生，其中以6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterin synthase，PTPS）缺乏最為常見[3]。本文對青島地區(qū)26 例PTPS 缺乏癥（6-pyruvoyltetrahydropterin synthase deficiency，PTPSD）患兒臨床特征進(jìn)行總結(jié)，并研究其基因變異規(guī)律及特點(diǎn)，為PTPSD早期診斷、治療及遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以1996 年11 月至2021 年12 月青島市經(jīng)新生兒疾病篩查確診的251 例HPA 患兒為研究對象，所有患兒進(jìn)行尿蝶呤譜分析、紅細(xì)胞二氫蝶呤還原酶（dihydropteridine reductase,DHPR）活性測定、BH4負(fù)荷試驗或基因分析以確診BH 4 D。BH 4 D 均按2014年《高苯丙氨酸血癥的診治共識》進(jìn)行診斷，其診斷符合：①血苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)水平＞120 μmol/L及血Phe與酪氨酸(tyrosine，Tyr)比值(Phe/Tyr)＞2.0，診斷為HPA；②PTPS缺乏時，尿新蝶呤（neopterin，N）明顯升高，生物蝶呤（biopterin，B）極低，生物蝶呤百分率［B/（B+N）×100%］＜10%，血紅細(xì)胞DHPR活性正常[4]。

1.2 尿蝶呤譜分析和DHPR測定

收集新鮮尿液加入抗壞血酸，浸透專用濾紙上避光晾干，同時收集患兒靜脈血制成干血斑標(biāo)本，所有標(biāo)本外送上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院新生兒篩查中心進(jìn)行尿蝶呤譜分析及DHPR活性測定。

1.3 基因分析

用 EDTA 抗凝管抽取患兒外周靜脈全血 3 mL，過柱法提取DNA，應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)對BH4D的相關(guān)基因進(jìn)行直接測序。

1.4 隨訪及智力評估

BH 4 D 患兒定期監(jiān)測血Phe 濃度，每3～6 個月門診隨訪1 次，檢測血常規(guī)、肝功能，并進(jìn)行生長發(fā)育評估和智能發(fā)育檢測。隨訪時間截止至2022 年6月3日。6歲以內(nèi)患兒采用Gesell兒童發(fā)育量表進(jìn)行智力檢測(developmental quotient，DQ)，DQ評分低于84 分為智力落后；6 歲以上患兒采用韋氏兒童智力發(fā)育量表對智商(intelligence quotient，IQ)進(jìn)行檢測，IQ評分70～79為邊緣落后狀態(tài)，低于70分為智力落后。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用x±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（M）表示。

2 結(jié)果

2.1 PTPSD發(fā)病率及尿蝶呤譜、血DHRP活性測定

青島市自1996年11月開展新生兒疾病篩查，至2021年12月共篩查1 889 081名新生兒，確診HPA患兒251例。經(jīng)尿蝶呤譜、血DHPR活性、BH4D負(fù)荷試驗或基因檢測，診斷BH4D 26例。26例患兒尿蝶呤譜均表現(xiàn)為N/B極度增高[(56.36±44.22)%]，B%顯著降低[(2.96±2.21)%]；血DHPR均在正常范圍，故均符合PTPSD診斷。

26例患兒來自23個家庭，其中2對為單卵雙胞胎，1對為非同胎生姐妹，PTPSD發(fā)病率為12.7/100萬（雙胎按1例計算）。26例PTPSD患兒中，男14例、女12例，均為足月出生，出生體重為（3.15±0.40）kg，新生兒篩查血Phe平均濃度為（8.76±5.19）ng/dL。

8 例患兒進(jìn)行B H 4 負(fù)荷試驗，均在服用BH 4 后出現(xiàn)特征性的快速下降，2 小時內(nèi)下降（67.63±15.47）%，4小時后下降（86.14±5.43）%至正常水平。

2.2 基因檢測結(jié)果

19例PTPSD患兒（來自17個家庭）進(jìn)行基因檢測，其中包括單卵雙胞胎1對、非同胎生姐妹1對（等位基因相同，均按1例計算）。17個家系的34個PTS等位基因均檢出變異，共檢出10種變異類型（表1），包含錯義變異、剪接變異兩種變異類型，其中錯義變異發(fā)生率為91.17%（31/34），為最常見的變異類型。10 種變異類型中，9 種來源于外顯子，1 種來源于內(nèi)含子。變異位點(diǎn)主要集中在5號外顯子，占所有變異類型的67.6%（23/34），本研究中10種變異類型在BIODEF數(shù)據(jù)中均被報道過。

表1 青島地區(qū)PTPSD患兒PTS基因變異特點(diǎn)

2.3 基因型與表型的關(guān)系

19 例進(jìn)行基因檢測的PTPSD 患兒中，7 例確診年齡＞3 月齡，出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，臨床診斷為嚴(yán)重型PTPSD；3 例確診后未進(jìn)行規(guī)范治療，無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，診斷為輕型PTPSD。見表2（病例1～10）。

2.4 治療及隨訪

19例行基因檢測的PTPSD患兒，末次隨訪中位年齡6.1（1.08～24）歲。所有患兒身高、體重均位于正常同年齡、同性別兒童的P10～P97，提示生長發(fā)育正常。16 例接受規(guī)范治療，其中15 例智力發(fā)育正常，9 例DQ(92.2±2.5)分，2 例IQ分別是93和94分，4例通過醫(yī)師綜合評價；1例智力落后，因確診年齡晚所致（例7）。3例未進(jìn)行規(guī)范治療的患兒（例8～例10），末次智力評估均正常。見表2。

表2 19例PTPSD患兒臨床特征和基因型

7 例未行基因檢測的患兒，1 例1 歲時因肺炎死亡，2 例失訪，2 例智力檢測正常，2 例智力落后（1 例生后3 月齡確診PTPSD，因家庭原因未規(guī)范服用治療藥物，1 例確診年齡2 歲，就診時即存在智力落后）。

3 討論

BH 4 D 是一類具有高度遺傳異質(zhì)性的疾病，約占HPA人群的1%～20%[2]。我國自1981年開展新生兒HPA 篩查，后逐漸引進(jìn)尿蝶呤分析、BH 4 口服負(fù)荷試驗、DHPR 活性檢測、基因分析等，以鑒別各型BH4D。青島市新生兒疾病篩查中心自1996年開展新生兒篩查起即注意BH4D的鑒別診斷，2005年首次對本中心診斷的7例BH4D患兒臨床特征進(jìn)行總結(jié)報道[5]，為BH4D的診治提供了臨床經(jīng)驗。

BH4D在不同地區(qū)、不同種族HPA中發(fā)生率具有差異，中東、亞洲人群發(fā)生率較高[6-7]，在我國也有顯著的地區(qū)差異。我國一項來自上海、徐州、廣西和南京等地區(qū)篩查研究顯示，800多例HPA患者中，BH4D占8.2%[8]，而河南地區(qū)發(fā)生率僅為4.1%[9]。本研究中BH4D占HPA患兒的10.3%，高于我國其他地區(qū)報道。BH4D全球發(fā)病率尚不明確，不同國家之間存在很大差異。我國一項全國范圍的研究發(fā)現(xiàn)BH4D發(fā)病率為3.8/100萬，其中東部、北部地區(qū)發(fā)病率較高（5.9/100萬、4.1/100萬），南部和西北部地區(qū)發(fā)病率分別為1.6/100萬、1.7/100萬[10]。本研究青島地區(qū)BH4D(均為PTPSD)發(fā)病率為12.7/100萬，明顯高于既往文獻(xiàn)報道。

目前PTPSD是最為常見BH4D類型。國外研究顯示PTPSD占BH4D的57%[2]，而中國大陸人群中該比例可高達(dá)96%[11-12]。本研究中BH4D患兒均為PTPSD，與文獻(xiàn)報道基本一致。PTS基因位于第11號染色體(11p2.2.3)，共包含6個外顯子，人PTS基因cDNA 在1992 年首次被克隆[13]。截止2022 年6 月，BIOPKU 數(shù)據(jù)庫已收錄198 種PTS基因變異，其中c.155A＞G、c.259C＞T、c.272A＞G和c.286G＞A是中國人群最常見的變異。本研究中，青島市PTPSD患兒PTS基因變異以復(fù)合雜合變異為主，具有明顯的熱點(diǎn)變異，c.259 C＞T 是主要的變異類型，其次為c.286G＞A，發(fā)生率為18%，這與我國河南、四川等地區(qū)變異特征相一致[9,12]。同時，c.272 A＞G 也是青島地區(qū)BH4D人群的熱點(diǎn)變異之一，變異發(fā)生率為13%，河南、四川、南方等地區(qū)的報道[9,11-12]。BIOPKU數(shù)據(jù)庫顯示PTS變異位點(diǎn)主要位于5號和6號外顯子，本研究中PTS基因變異頻率最高的也是5號外顯子，對PTS基因外顯子5進(jìn)行基因變異位點(diǎn)檢測，可大大提高基因診斷的效率，降低成本，可早期診斷PTPSD患兒。

BH4D臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度受多種酶活性影響，有多項研究對PTS基因不同變異類型進(jìn)行功能驗證，已證實(shí)c.200C＞T、c.259C＞T、c.286G＞A導(dǎo)致PTPS酶活性為野生型的63%、52%和10%，多導(dǎo)致嚴(yán)重型PTPSD[14-15]。本研究中，6 例嚴(yán)重型PTPSD 患兒均攜帶該3種變異，與文獻(xiàn)報道一致。由于本研究中心尚未開展腦脊液神經(jīng)代謝產(chǎn)物的測定，且新生兒篩查早期患兒多無臨床癥狀，故BH4D輕型與嚴(yán)重型分型困難。本研究中8 例進(jìn)行基因檢測的PTPSD尚未明確臨床分型，無法明確其基因型和表型之間的相關(guān)性，但根據(jù)已統(tǒng)計的基因型與表型的關(guān)系及臨床隨訪結(jié)果顯示，攜帶c.166 G＞A、c.272 A＞G、c.276T＞A基因型可能與輕型PTPSD有關(guān)[16-17]，而攜帶有c.155A＞G、c.317C＞T、c.200C＞T、c.259C＞T、c.286G＞A的變異基因型則與嚴(yán)重型PTPSD有關(guān)[14-16]。

值得注意的是，本研究中3 例攜帶c.84-291 A＞G 變異的患兒未接受規(guī)律藥物治療，目前隨訪血苯丙氨酸濃度及智力發(fā)育均正常。c.84-291 A＞G位于PTS基因的內(nèi)含子1，影響mRNA的剪接過程，該變異可產(chǎn)生3種剪接mRNA：正常長度、外顯子3缺失、79 bp假外顯子插入，其中正常長度的mRNA占23.8%～37%[18-19]。由于該變異仍能產(chǎn)生正常長度的拼接產(chǎn)物，能夠維持部分PTPS的酶活性，從而導(dǎo)致輕型PTPSD。我國學(xué)者報道3例攜帶c.84-291 A＞G變異的PTPSD患兒在診斷早期即停止藥物治療，隨訪過程中血苯丙氨酸維持正常，與本研究結(jié)果相一致[19]。

BH 4 D 患兒在新生兒期多無任何臨床表現(xiàn)，與苯丙氨酸羥化酶缺乏癥難以區(qū)分，當(dāng)給予低/無Phe奶粉喂養(yǎng)后血Phe 水平可很快下降，誤以為治療有效，而一旦出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害，易導(dǎo)致嚴(yán)重的智力障礙等后遺癥[20]。目前隨著BH 4 D 診療水平的提高，多數(shù)患兒在3 個月內(nèi)即可進(jìn)行診斷。本研究中近10年出生的BH4D患兒有92%（12/13）在生后2個月確診，早期給予相應(yīng)治療，目前該部分患兒智能測試結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，提示早期診斷及治療可明顯改善患兒預(yù)后。目前多采用補(bǔ)充BH4及神經(jīng)遞質(zhì)前體左旋多巴、5-羥色氨酸聯(lián)合治療。但在開展新生兒篩查的初期診斷，部分患兒因診斷當(dāng)時無BH4藥物等聯(lián)合治療或因經(jīng)濟(jì)原因而放棄。青島市自1996年11月開展新生兒疾病篩查工作至今已經(jīng)歷26年，BH4D從診斷難到治療難，從確診患兒的缺藥、少藥、求藥到2012年在全國率先將治療藥物納入醫(yī)療保險體系，解決了家庭沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使患兒得以長期終生治療。青島地區(qū)診斷的第1 例病例目前年齡24歲，已經(jīng)步入社會，正常工作生活。患兒的健康成長得益于新生兒疾病篩查-診斷-治療及其長期隨訪-救助的一體化管理體系。

綜上所述，1996-2021年25年間青島市新生兒BH4D平均發(fā)病率為12.7/100萬，最常見的變異基因為PTS，基因檢測有助于BH4D的診斷，對已經(jīng)明確基因變異的患兒進(jìn)行家系分析和遺傳咨詢,有利于提高出生人口素質(zhì)。早期診斷，盡早使用BH 4 和神經(jīng)遞質(zhì)前體進(jìn)行治療，可以有效降低BH4D患兒神經(jīng)系統(tǒng)損害，減少后遺癥的出現(xiàn)，達(dá)到降低殘疾兒發(fā)生率的目的。通過新生兒疾病篩查，早期診斷和治療是患兒健康成長的關(guān)鍵。建立完善的新生兒疾病篩查-診斷-治療-長期隨訪-救助的一體化管理體系是作好出生缺陷第三級預(yù)防，降低殘疾兒發(fā)生，提高人口素質(zhì)的有力措施。