抗衰老蛋白Klotho對急性腎損傷中氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用研究進(jìn)展

高麗梅，張紫怡，覃志成

1 山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科，太原 030000；2 山西省腎臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

急性腎損傷（AKI）是一組以急性腎功能減退為特征的臨床綜合征，具有高發(fā)病率、高病死率，是全球關(guān)注的衛(wèi)生健康問題之一。研究顯示，氧化應(yīng)激及其全身效應(yīng)在AKI 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［1］。因此，找到一種針對腎細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)劑，對預(yù)防或控制AKI 的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。Klotho 是1997 年由KURO-O 等［2］研究自發(fā)性高血壓小鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種基因，當(dāng)該基因缺陷時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠會(huì)表現(xiàn)出生長緩慢、壽命縮短、血管鈣化、骨質(zhì)疏松等類似人類早衰的特征，其編碼的蛋白為Klotho 蛋白，分為膜型和分泌型兩種。膜型 Klotho是一種單跨膜蛋白，主要表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管與近曲小管，作為成纖維生長因子23（FGF23）的共受體，參與機(jī)體磷代謝［3］。分泌型Klotho 主要存在于血液中，也有少量存在于尿液和腦脊液，可作用于骨骼、腦、心、肺等遠(yuǎn)端器官，發(fā)揮抗衰老、抗氧化、抗凋亡、抗炎及保護(hù)血管等多重生物學(xué)作用［4］。研究表明，AKI 患者存在Klotho 缺乏，并伴有氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)， Klotho外源性給藥或過表達(dá)具有腎保護(hù)作用，其潛在機(jī)制尚不完全明確［5］。本文總結(jié)了Klotho 對AKI 中氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用，為臨床預(yù)防和治療AKI提供更多可能。

1 激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxOs）活性抑制AKI 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

FoxOs是2000年才正式發(fā)布統(tǒng)一命名的蛋白質(zhì)家族，參與多種細(xì)胞生理過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、活性氧（ROS）反應(yīng)以及細(xì)胞周期、代謝調(diào)節(jié)等［6］，其中FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6 在人類不同組織中廣泛表達(dá)。激活FoxOs 可上調(diào)諸如過氧化氫酶和含錳的超氧化物歧化酶（Mn-SOD）等多種抗氧化基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho 可降低FoxOs 磷酸化水平，并促進(jìn)其核易位，核FoxO 可直接與Mn-SOD 啟動(dòng)子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，從而促進(jìn)ROS 的去除，并增加對氧化應(yīng)激的抵抗力［8］。

KUROSU 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白作為一種循環(huán)激素，可與細(xì)胞表面受體結(jié)合抑制胰島素/胰島素樣生長因子1（IGF-1）的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，發(fā)揮其抗衰老特性。研究證實(shí)，F(xiàn)oxOs 是胰島素樣信號傳導(dǎo)的下游靶標(biāo)［10］。一項(xiàng)對秀麗線蟲的遺傳學(xué)研究表明，胰島素/IGF-1 可激活PI3K/Akt 通路，抑制哺乳動(dòng)物FoxOs 蛋白的線蟲同源基因DAF-16 活性，由此推測Klotho 蛋白可通過激活由胰島素/IGF-1/PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)的FoxOs，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用［11］。研究顯示，在他克莫司（Tac）誘導(dǎo)的腎損傷小鼠模型中，其腎組織DNA 氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、血肌酐、磷酸化Akt、FoxO3a表達(dá)均升高， Mn-SOD 免疫反應(yīng)性及其mRNA 表達(dá)均降低，而補(bǔ)充Klotho可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)Klotho 通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路，并增強(qiáng)FoxO3a 介導(dǎo)的Mn-SOD 表達(dá)，從而減輕Tac 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［12］。

此外，部分研究提出Klotho 還可通過血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶（SGK）［13］、p53/p21［14］、β-連環(huán)蛋白［15］等途徑調(diào)節(jié)FoxOs 活性，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。

2 激活核因子紅系2 相關(guān)因子2（Nrf2）抑制AKI中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

Nrf2 是一種抗氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，具有六個(gè)功能域，分為Neh1～6 結(jié)構(gòu)域；當(dāng)靜息狀態(tài)下，Neh2結(jié)構(gòu)域與Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，促進(jìn)Nrf2 泛素化并被蛋白酶體系統(tǒng)降解，所以細(xì)胞內(nèi)的Nrf2 一般維持在較低水平。然而，當(dāng)暴露于氧化應(yīng)激條件下，Keap1 失去泛素連接酶活性，導(dǎo)致Nrf2易位到細(xì)胞核中，并與小MAF（sMAF）家族蛋白形成異二聚體，進(jìn)一步與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的增強(qiáng)子序列結(jié)合，誘導(dǎo)一系列如血紅素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、Mn-SOD 等抗氧化因子的表達(dá)［16］。

有研究通過體外高糖刺激足細(xì)胞及體內(nèi)糖尿病小鼠模型誘導(dǎo)氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，Klotho高表達(dá)組總Nrf2、核Nrf2及其下游靶標(biāo)如Mn-SOD 表達(dá)均升高，而這種增強(qiáng)作用被Nrf2 抑制劑完全抑制，這表明Klotho 誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激作用至少部分是由Nrf2信號介導(dǎo)的［17］。CUI等［18］通過H2O2誘導(dǎo)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，結(jié)果顯示Klotho可激活Nrf2的核易位，并增加抗氧化酶如Mn-SOD、HO-1 活性，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率，而應(yīng)用PI3K 抑制劑可阻斷Klotho 蛋白誘導(dǎo)的Nrf2/HO-1 激活和細(xì)胞保護(hù)作用。因此，Klotho 激活Nrf2 的能力主要取決于其激活PI3K/Akt信號級聯(lián)的能力，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。

3 激活環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號通路抑制AKI中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

cAMP 是ATP 在腺苷酸環(huán)化酶（ACs）催化下產(chǎn)生的核苷酸，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的第二信使，主要通過蛋白激酶A（PKA）及其下游效應(yīng)因子如cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）等調(diào)節(jié)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與許多生理和病理過程，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［19］。PKA 通常處于無催化活性狀態(tài)，當(dāng)與cAMP 結(jié)合時(shí)被激活，進(jìn)而磷酸化許多蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)cAMP/PKA 信號通路激活時(shí)，可抑制如NOX2、NOX4（NADPH 氧化酶同源物，脈管系統(tǒng)ROS主要來源）等氧化劑的活性，并促進(jìn)如Mn-SOD、谷胱甘肽等抗氧化因子的生成，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷［20］。

一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，Klotho 能增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cAMP 產(chǎn)物，并促進(jìn)Mn-SOD 表達(dá)、增強(qiáng)SOD活性，而應(yīng)用cAMP 抑制劑后上述改變被抑制，表明Klotho可通過cAMP依賴性途徑上調(diào)抗氧化劑產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［21］。WANG 等［22］建立了Klotho 基因轉(zhuǎn)染的大鼠主動(dòng)脈平滑?。≧ASM）細(xì)胞模型，結(jié)果顯示相較于對照組，Klotho 轉(zhuǎn)染組RASM細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平和PKA 活性增加，并且PKA 的激活是呈cAMP依賴性的，而競爭性cAMP抑制劑的應(yīng)用抑制了cAMP 依賴性PKA 的活性，進(jìn)而消除了Klotho 誘導(dǎo)的Nox2 蛋白表達(dá)抑制，提示Klotho 誘導(dǎo)的Nox2 蛋白表達(dá)抑制可能由cAMP/PKA 途徑介導(dǎo)的。因此，Klotho 可通過cAMP/PKA 信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

4 減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）抑制AKI 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是真核細(xì)胞中氧化性蛋白、脂質(zhì)等合成的重要細(xì)胞器，在氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用。在應(yīng)激（如低氧、病原體感染、脂質(zhì)累積等）條件下，ER 穩(wěn)態(tài)被破壞，使未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白累積，超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控能力，即觸發(fā)ERS，而脂質(zhì)代謝異常及大量蛋白質(zhì)折疊可產(chǎn)生大量的ROS［23］。體內(nèi)和體外研究均已證明，ERS在缺氧再灌注（I/R）誘導(dǎo)的腎損傷中起關(guān)鍵作用［24］。研究顯示，ERS 可能通過激活蛋白激酶RNA 樣ER 激酶（PERK）、激活轉(zhuǎn)錄因子6α（ATF6α）和肌醇需求酶1α（IRE1α）途徑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［25］。

CUI等［26］建立了H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于模型組，Klotho 干預(yù)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞存活率升高，而這種結(jié)果隨著PI3K 抑制劑LY294002 的應(yīng)用被完全逆轉(zhuǎn)，提示Klotho 蛋白可明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt 通路，抑制內(nèi)皮細(xì)胞ERS 有關(guān)。有研究將腎毒性血清（NTS）注入小鼠體內(nèi)建立腎損傷模型，結(jié)果顯示相較于對照組， NTS 組尿蛋白、尿素及未折疊蛋白反應(yīng)途徑的主要調(diào)節(jié)因子 78 kDa 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）水平更高，提示該模型可誘導(dǎo)ERS，且Klotho 干預(yù)組對比NTS 組腎損傷及GRP78 含量降低，表明Klotho 的腎臟保護(hù)特性至少部分是通過ERS 調(diào)節(jié)介導(dǎo)的［27］。此外，陳鋮等［28］通過硫酸吲哚酚（IS）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探討ERS 是否參與此過程及可能的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與IS組比較，Klotho組ERS相關(guān)蛋白表達(dá)均降低，同時(shí)磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）上調(diào)，而Klotho 蛋白的這種作用可被AMPK通路抑制劑阻斷，提示Klotho 蛋白可能通過激活A(yù)MPK 通路而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而拮抗IS 對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。

5 減輕線粒體功能障礙抑制AKI 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

腎臟是人類最需要能量的器官之一，線粒體含量僅次于心臟。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙在AKI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而內(nèi)源性ROS 的主要來源是線粒體的氧化磷酸化系統(tǒng)，并且包括清除氧自由基的關(guān)鍵酶Mn-SOD 在內(nèi)的抗氧化劑亦在線粒體基質(zhì)中表達(dá)，從而保持氧化還原平衡［29］。當(dāng)腎細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，線粒體ROS 生成增多而抗氧化系統(tǒng)受損，導(dǎo)致腎組織受到氧化應(yīng)激損傷［30］。MIAO等［31］建立了單側(cè)腎缺血再灌注（UIRI）小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于UIRI 組，Klotho 干預(yù)組ROS 水平下降，線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)升高，同時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變得到改善，這些結(jié)果表明Klotho 在保護(hù)腎細(xì)胞線粒體功能方面發(fā)揮著重要作用。然而目前關(guān)于Klotho 通過改善線粒體功能障礙發(fā)揮抗氧化作用的研究仍較少，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

6 促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）表達(dá)抑制AKI中的氧化應(yīng)激反應(yīng)

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種由腎臟產(chǎn)生的糖蛋白激素，因其與血細(xì)胞表面EPOR 結(jié)合而促進(jìn)造血被廣泛熟知。EPOR 除表達(dá)于血細(xì)胞，也表達(dá)于非造血組織，如腎臟、心臟、大腦等。EPOR 可分為兩類，一類為EPOR 的同源二聚體（EPOR）2，一類為EPOR 和β 共同受體（βCR）形成的異源二聚體（EPOR/βCR），EPO與（EPOR）2結(jié)合促進(jìn)紅細(xì)胞生成，而與EPOR/βCR 結(jié)合具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用［32］。有研究通過葡萄糖氧化酶（GO）培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn) GO 確實(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累，而應(yīng)用EPO 可減少ROS的產(chǎn)生，并提高EPOR 的膜表達(dá)，提示EPO 可通過抑制ROS 的產(chǎn)生來保護(hù)人腎小管上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，而這種保護(hù)作用是由EPOR 介導(dǎo)的［33］。HU 等［34］通過H2O2誘導(dǎo)進(jìn)行了腎細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Klotho 可上調(diào)腎臟EPOR 表達(dá)，放大EPO 觸發(fā)的信號通路，保護(hù)腎細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，相反 EPOR 缺失會(huì)導(dǎo)致這種作用部分被消除，這表明EPOR 是參與Klotho 細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的下游信號傳導(dǎo)因子。

綜上所述，Klotho 改善AKI 的抗氧化應(yīng)激機(jī)制主要包括激活FoxOs、Nrf2、cAMP/PKA 信號通路及減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕線粒體功能障礙、促進(jìn)EPOR表達(dá)等。而參與這些過程的通路相互關(guān)聯(lián)或重疊，目前了解還不夠全面，有待進(jìn)一步深入研究，從而為開發(fā)新型抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)，也為臨床AKI 患者的預(yù)防和治療提供新的思路。