腸道微生物來源細胞外囊泡在炎癥性腸病中作用的研究進展

周厚法，孫琦，馬穎才

1 青海大學研究生院，西寧 810000；2 青海省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

炎癥性腸?。↖BD）是胃腸道的一種慢性自身免疫性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）［1］。IBD 在西方國家較為常見，在中國曾被認為是罕見病。但近年來隨著飲食習慣改變和生活方式轉(zhuǎn)變，我國IBD 的發(fā)病率逐年上升，并且發(fā)病人群趨向年輕化［2］。IBD 的發(fā)病機制非常復雜，除了與遺傳因素和免疫微環(huán)境有關(guān)外，還與腸道微生物密切相關(guān)［3］。細胞外囊泡（EVs）是一種由細胞釋放至細胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，是細胞間通信的重要介質(zhì)，對腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要［4］。腸道微生物來源的EVs 可在調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能和免疫細胞募集中發(fā)揮重要作用，能夠參與IBD 腸黏膜損傷修復及功能調(diào)節(jié)［5］。本文結(jié)合文獻就腸道微生物來源EVs 在IBD 中作用的研究進展作一綜述。

1 EVs概述

1.1 EVs 分類 EVs 是一種由細胞釋放至細胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，是細胞間通信的重要介質(zhì)。根據(jù)EVs的生物發(fā)生、大小和生物物理性質(zhì)，大致分為外泌體、微泡、凋亡小體三類。外泌體是直徑30～150 nm、具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的EVs。外泌體被認為幾乎存在于所有活細胞中，還可從血液、尿液、腦脊液等體液中分離出來。微泡是直徑50～1 000 nm、由磷脂雙分子層包圍的膜結(jié)構(gòu)，主要通過鈣調(diào)節(jié)途徑從血漿中產(chǎn)生，具有促凝血功能［6］。凋亡小體是細胞骨架斷裂時在起泡和細胞碎片分解過程中形成的，直徑1～5 μm。有研究認為，凋亡小體可參與自身免疫性疾病、癌變、感染等病理生理過程［7］。以上分類是基于真核生物系統(tǒng)，不包括細菌釋放的膜囊泡（MVs）。然而，MVs脫落在細菌中普遍存在，本文將其納入EVs。MVs 最初被發(fā)現(xiàn)起源于革蘭陰性菌外膜，通常被稱為外膜囊泡（OMV）。最近研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陽性菌亦可產(chǎn)生MVs。根據(jù)MVs 的結(jié)構(gòu)和組成差異分為OMV、革蘭陰性菌的外-內(nèi)膜囊泡（OIMV）和革蘭陽性菌的胞質(zhì)膜囊泡（CMV）［4］。OMV 是由革蘭陰性菌外膜的脂多糖外層和磷脂內(nèi)層組成的球形顆粒，富含特定的脂質(zhì)和外膜蛋白；OIMV 是細菌DNA 的主要載體，而CMV 源于泡沫細胞死亡和細菌自溶素。

1.2 EVs 組成及其生理功能 盡管EVs 的組成取決于生物發(fā)生途徑、細胞類型和生理條件，但幾乎所有EVs都包含蛋白質(zhì)、脂類、核苷酸和代謝產(chǎn)物等。

蛋白質(zhì)是EVs 的重要組成部分，如外泌體標志性跨膜蛋白CD63、CD81、CD9，這些蛋白可靶向特定細胞，如內(nèi)皮細胞，能夠促進血管生成。而在腸道微生物來源的EVs中發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白，包括HSP70、HSP90 及主要組織相容性復合物，可參與抗原處理和抗原提呈［8］。EVs 中攜帶的核苷酸主要有DNA、rRNA、tRNA、mRNA 和sRNA，這些核苷酸可干擾宿主基因轉(zhuǎn)錄，抑制蛋白質(zhì)合成［9］。EVs 中的RNA 進入細胞質(zhì)可直接影響靶細胞內(nèi)相關(guān)基因的表達。EVs中的sRNA 通過轉(zhuǎn)錄、翻譯或mRNA 加工可削弱或增強靶細胞內(nèi)相關(guān)RNA 的表達［10］。EVs 中的脂質(zhì)可作為藥物載體發(fā)揮作用。OMV 中糖脂和糖蛋白能夠改變細胞組成并具有將生物活性分子引入細胞內(nèi)的潛力［11］。

EVs通過向靶細胞傳遞效應因子來調(diào)控宿主細胞，從而促進腸道菌群與宿主細胞的相互作用。致病菌中的毒力因子、毒素和免疫調(diào)節(jié)效應物能夠幫助細菌侵入宿主細胞，擾亂宿主免疫防御機制，從而獲得免疫逃逸［10］。而在共生菌中，EVs 作為細菌介質(zhì)，可改善免疫系統(tǒng)并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［12］。

2 腸道微生物與IBD的關(guān)系

迄今為止，IBD 的病因和發(fā)病機制尚不明確。普遍認為，腸道微環(huán)境失調(diào)是IBD 發(fā)病的重要機制之一。目前已發(fā)現(xiàn)的230 余個IBD 易感基因中，大多數(shù)與腸黏膜屏障功能異常有關(guān)［13］，表明微生物群改變可能是引起腸道慢性炎癥的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，IBD 患者腸道微生物群存在多樣性和豐度改變［14］。腸道微生物來源的EVs 是宿主-細菌相互作用的重要調(diào)節(jié)因子，但其在IBD 發(fā)病機制中作用的重要性卻被忽視了。隨著微生物群變化，IBD 患者腸道微生物來源的EVs 組成也發(fā)生了改變，如變形桿菌的EVs 豐度增加、厚壁菌的EVs 豐度降低［15］。因此，深入研究IBD 腸道微生物來源的EVs特征，將為IBD診斷和治療提供新的思路。

3 EVs在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用

EVs 是微生物與腸上皮細胞（IECs）、內(nèi)皮細胞和免疫細胞通信的重要介質(zhì)［16］，不僅參與腸上皮屏障功能維持，還是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑。IBD 的發(fā)病機制與腸黏膜屏障功能障礙、免疫學異常和腸道細胞代謝紊亂密切相關(guān)，而腸道微生物來源的EVs 可通過維持腸上皮屏障完整性、調(diào)控免疫反應和細胞代謝，參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。

3.1 維持腸上皮屏障完整性 腸上皮屏障完整性是腸道抵抗各種毒素和病原體的關(guān)鍵。IECs 作為腸上皮屏障的重要組成部分，主要受免疫細胞、腸道微生物和EVs中核苷酸的影響。IBD 患者IECs被破壞，可導致腸上皮屏障完整性喪失。腸道微生物可通過抑制腸上皮炎癥反應、加強緊密連接，促進腸上皮屏障完整性恢復，從而緩解IBD。

由于腸道微生物具有多樣性，腸道微生物來源的EVs作用各不相同。擬桿菌來源的EVs可保護酶免受胃腸道蛋白酶降解，促進細胞內(nèi)Ca2+信號傳遞，從而維持消化系統(tǒng)的生理功能［17］。大腸桿菌來源的EVs 能夠誘導IECs 釋放促炎癥細胞因子IL-6，而嗜黏蛋白阿克曼菌來源的EVs則抑制這一過程［18］。另外，一些益生菌分泌的MVs 有助于增強腸上皮屏障功能和維持緊密連接結(jié)構(gòu)，如大腸桿菌菌株Nissle1917（EcN）可通過激活NOD1信號通路和調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達，增強IBD 患者腸上皮屏障功能。此外，EcN 衍生的OMV 被證實具有抗炎、增強腸上皮屏障功能和緩解UC 的作用［19］。因此，作為腸上皮屏障功能的調(diào)節(jié)因子，腸道微生物來源的EVs 在維持IBD腸上皮屏障完整性方面發(fā)揮了重要作用。

3.2 調(diào)控免疫反應 腸道微生物來源的EVs 可通過直接或間接激活免疫細胞受體，調(diào)節(jié)宿主免疫反應。EVs 可激活I(lǐng)ECs 促進免疫細胞IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 表達［20］。脆弱擬桿菌的OMV 可通過Toll 樣受體2 與樹突狀細胞（DCs）相互作用，誘導產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T 細胞分化，抑制三硝基苯磺酸誘導的結(jié)腸炎［21］。而腸道致病菌則可利用OMV 實現(xiàn)入侵。源于空腸彎曲菌的OMV 是細菌性食源性胃腸炎的主要致病原因，可通過E-cadherin 和閉合蛋白裂解增加細菌黏附與侵襲?；魜y弧菌是霍亂的主要毒力因子，可分泌具有霍亂毒素的OMV，OMV 可通過IECs 上的霍亂毒素受體內(nèi)化，并以NOD1 依賴的方式激活MAPK 和NF-κB 信號通路，從而導致促炎癥細胞因子增多［22］。因此，腸道微生物來源的EVs在腸道穩(wěn)態(tài)和IBD發(fā)病機制中具有重要作用。

3.3 調(diào)控細胞代謝 腸道微生物來源的EVs 還可調(diào)控腸道細胞代謝，如參與腸道細胞能量需求的短鏈脂肪酸和各種酶代謝。脆弱芽孢桿菌作為腸道益生菌，其衍生的MVs 中含有多種酶，可促進腸道多糖消化［23］。細菌MVs 中有很多代謝物可在宿主-細菌相互作用中發(fā)揮重要作用。多形擬桿菌可通過上調(diào)轉(zhuǎn)運蛋白NPC1L1 來介導腸道膽固醇吸收［23］。而攜帶毒素的病原體MVs 則可誘導腸道炎癥反應，破壞腸上皮屏障完整性。

4 EVs在IBD診斷與治療中的應用

4.1 EVs 在IBD 診斷中的應用 作為臨床診斷的生物標志物，EVs的靶向性較高，其提供的生物學信息非常豐富。有研究發(fā)現(xiàn)，CD147 陽性的結(jié)直腸癌（CRC）患者EVs 水平顯著升高，并認為EVs 是診斷CRC 的敏感生物標志物；該研究還發(fā)現(xiàn)，CRC 患者外泌體miR-19a 表達顯著升高，并可作為預測CRC復發(fā)的生物標志物［24］，而CRC 與IBD 密切相關(guān)，IBD患者罹患CRC 的風險顯著增加。有研究報道，降低miR-214 表達可緩解小鼠結(jié)腸炎癥和降低結(jié)腸炎相關(guān)癌變的發(fā)生風險，從外泌體中分離的miRNA 已被證實比其他生物標志物更穩(wěn)定、更可靠［25］。這些研究提示EVs具有監(jiān)測IBD 癌變進展的潛力。除了結(jié)腸鏡檢查外，現(xiàn)有的生物標志物都無法單獨準確診斷IBD。臨床上缺乏一種能夠單獨并準確診斷IBD的特異性生物標志物［26］，故建立一個基于EVs 的IBD 診斷系統(tǒng)是非常有必要的。有研究發(fā)現(xiàn)，在IECs衍生的EVs中ANXA1表達增加、從唾液中分離的外泌體PSMA7 過表達，二者有可能成為IBD 臨床診斷的特異性標志物［27］。但目前缺乏有效的EVs純化技術(shù)，這嚴重制約了其臨床應用。

4.2 EVs在IBD治療中的應用 EVs在疾病治療中具有獨特優(yōu)勢，其治療途徑主要分為四類：①利用EVs 誘導免疫抑制或免疫刺激作用，包括抗菌、抗炎、抗腫瘤作用或利用EVs 作為間充質(zhì)干細胞移植的替代方案；②利用生物工程技術(shù)將EVs 作為輸送藥物的納米載體，將特定的核苷酸、蛋白質(zhì)或藥物制劑運送至靶細胞或組織；③利用EVs 誘導組織再生和組織修復；④利用EVs 作為治療腫瘤或感染的新型疫苗。

間充質(zhì)干細胞來源的EVs（MSCs-EVs）已被證實可用于治療炎癥性疾病，包括IBD。MSCs-EVs 治療IBD 的主要機制是減少結(jié)腸巨噬細胞浸潤、降低炎癥細胞因子水平和抑制NF-κB 信號通路，尤其是在腸道炎癥暴露后［28］。腸道免疫系統(tǒng)異常是IBD 的重要發(fā)病原因。因此，免疫細胞來源的EVs 可作為IBD 治療的靶點。如由DCs 衍生的EVs 可通過免疫刺激或免疫抑制作用緩解IBD 進展。近年來，EVs作為藥物載體的潛力備受關(guān)注。在IBD 中，各種有效的蛋白質(zhì)、RNA 和小分子藥物可直接或間接地包裝在來自IECs、人胚胎腎細胞和免疫細胞的EVs中，然后被腸道吸收［29］。IBD 患者較健康人更易感染艱難梭菌［30］，傳統(tǒng)抗菌藥物在感染部位很難達到有效殺菌濃度，需多次給藥才能維持有效的殺菌濃度，不僅增加了全身毒性，還會使腸道穩(wěn)態(tài)進一步被破壞，而負載抗生素的OMV 可高效殺死細菌，并且不會導致全身性傳播。結(jié)合對MVs 的靶向修飾，負載抗生素的MVs對單一菌株的殺傷力顯著提高［31］。但EVs作為輸送藥物的納米載體，其質(zhì)量標準體系和修飾技術(shù)尚有待于進一步提升。MVs在誘導細胞免疫和黏膜免疫方面具有顯著效果。目前，MVs 已研發(fā)出用于預防流感、冠狀病毒、人類免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒等感染的疫苗［32］，而基于MVs 預防IBD 的疫苗尚未研制成功，但MVs 可作為潛在的免疫增強劑來增強機體免疫力，是一種易于實現(xiàn)的臨床途徑。

綜上所述，IBD 的發(fā)病機制與腸黏膜屏障功能障礙、免疫學異常和腸道細胞代謝紊亂密切相關(guān)，而腸道微生物來源的EVs可通過維持腸上皮屏障完整性、調(diào)控免疫反應和細胞代謝，參與IBD 的發(fā)生、發(fā)展。盡管EVs 在IBD 診斷與治療中具有獨特優(yōu)勢，應用前景非常廣闊，但其臨床應用仍然任重道遠。