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    GA118系列遺傳分析儀校準方法研究

    2023-02-23 04:55:34李英俞麗娟李澤倫公安部第一研究所
    警察技術 2023年1期
    關鍵詞:泳道電泳重復性

    李英 俞麗娟 李澤倫 公安部第一研究所

    引言

    根據《檢驗檢測機構資質認定管理辦法》《檢測和校準實驗室認可準則》《司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則》《公安機關DNA實驗室等級評定辦法》等文件法規(guī)要求,法庭科學實驗室應定期對儀器設備進行保養(yǎng)、維護、校準。法醫(yī)DNA實驗室的核心儀器法醫(yī)DNA遺傳分析儀屬于大型精密分析儀器,同樣需要進行定期校準,只有保證儀器功能正常及各項技術指標符合規(guī)定方可開展相關的DNA鑒定工作。長期以來我國法醫(yī)DNA實驗室使用的遺傳分析儀一直被國外公司壟斷,國內也沒有相應的校準規(guī)范,因此第三方計量校準機構無法對遺傳分析儀進行校準,實驗室人員由于缺乏對儀器原理和關鍵技術指標的深入了解也很難實施實驗室內部校準,只能依靠國外生產廠家來完成校準工作。針對上述情況,2020年7月2日,國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布了JJF 1838-2020《遺傳分析儀校準規(guī)范》(以下簡稱《校準規(guī)范》)并于2021年1月2日實施[1]。

    公安部第一研究所自2008年以來一直從事法醫(yī)DNA遺傳分析儀的研制工作,2014年研制成功我國首臺GA118-16A型遺傳分析儀,此后相繼研制成功GA118-16B、GA118-24B等多款機型[2]并應用到200多家公安機關DNA實驗室。在實戰(zhàn)應用中,我們制定了GA118系列遺傳分析儀的校準規(guī)范并一直在實驗室認證認可中實施。本文根據首次發(fā)布實施的《校準規(guī)范》,結合GA118系列遺傳分析儀的工作原理和關鍵技術參數,重新對GA118校準規(guī)范進行了修訂,在滿足《校準規(guī)范》的基礎上結合儀器實戰(zhàn)應用需求,研究探討新的校準方法并在實踐中得到成功應用。

    一、GA118系列遺傳分析儀的工作原理

    GA118系列遺傳分析儀基于毛細管電泳原理,如圖1所示,通過在毛細管內部注入凝膠并在兩端施加一定的高壓,利用凝膠的篩分效應將標記有不同熒光染料長度不同的DNA片段進行電泳分離,在檢測窗口處通過激光激發(fā)標記的熒光染料并對熒光信號進行采集,在面陣CCD內將熒光信號轉換為電信號,得到DNA片段的染料波長、電泳速度、峰高等信息并生成原始數據文件。電泳完成后生成的原始數據文件,可用FastSTR 、GeneMapperTMID-X或GeneMarker 等二級分析軟件進行分析。

    GA118系列遺傳分析儀在進行樣本電泳前首先需要建立兩個校正文件:空間校正和光譜校正??臻g校正通過將各通道毛細管成像到面陣CCD上,建立空間位置對應關系,如圖2所示;光譜校正通過電泳帶有不同熒光染料的熒光標準物,記錄不同波長熒光染料分光到CCD上的區(qū)域并建立光譜校正矩陣(Matrix),用于對5色或6色熒光染料進行數據采集和光譜解耦,如圖3所示。

    數據分析時,分析軟件首先根據設定的內標顏色、片段大小等信息識別內標峰并進行內標曲線擬合,一般提供多種擬合算法供用戶選擇,如圖4所示。Allellic Ladder中包含有各個基因座目前已知的所有等位基因標準物,如基因座D8S1179中所有已知基因分型為5,6,7……19[3],分別表示四堿基短串聯(lián)重復序列[TCTA]連續(xù)重復的次數,分型6代表連續(xù)重復6次:[TCTA]6。軟件根據每個Ladder 的峰值時間與內標標準曲線對比,計算出每個Ladder的片段長度并與給定值比較,長度誤差在允許范圍內為通過,所有Ladder通過后建立Ladder體系。樣本同樣與內標標準曲線對比得出片段長度,根據樣本峰的顏色、長度與建立的Ladder體系比對,要求長度誤差不超過±0.5bp,比對通過后標記出該樣本的分型結果,不通過則標記錯誤原因。

    二、校準方法及項目

    (一)校準原則

    本文制定的GA118系列遺傳分析儀校準規(guī)范力求遵循校準項目科學合理、操作方法簡單可行的原則,在包含《校準規(guī)范》中所有校準項目的同時,盡量保證規(guī)范的先進性與實用性,與實戰(zhàn)應用需求和實驗室具體情況相結合,參考的相關文獻包括:

    JJF 1838-2020《遺傳分析儀校準規(guī)范》;

    GB/T 37266-2018《法庭科學人類熒光標記STR復合擴增檢測試劑質量基本要求》;

    GA/T 1163-2014《人類DNA熒光標記STR分型結果的分析及應用》;

    GA/T 383-2014《法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范》;

    QZ/S 1504-2018《GA118-24B遺傳分析儀》。

    (二)校準參數

    GA118系列遺傳分析儀的校準參數包括:基線漂移和基線噪聲、定性測量重復性、定量測量重復性、泳道差異、檢測限、分辨力,其中分辨力是《校準規(guī)范》中沒有要求的,是為了保證法醫(yī)DNA實驗室STR分型結果的正確性增加的校準參數,現(xiàn)就各校準參數說明如下:

    (1)基線漂移和基線噪聲:《校準規(guī)范》中明確了基線漂移和基線噪聲的測量計算方法,GA118系列遺傳分析儀是多毛細管通道、多熒光染料的毛細管電泳儀,在具體校準中,分別計算每根毛細管通道的不同熒光染料的基線漂移和基線噪聲,以其最大值作為儀器的基線漂移和基線噪聲,計算過程采用儀器配套的FastSTR 分析軟件自動測量功能,可大幅度降低工作量,如圖所示為藍色熒光染料的基線噪聲,最高噪聲為67RFU。

    (2)定性測量重復性:《校準規(guī)范》中以每根毛細管DNA標準物質(如:300bp片段DNA標準物質)的相對遷移時間相對標準偏差最大的作為儀器定性測量重復性,在實際操作中存在諸多不便,首先是遷移時間測量比較繁瑣,分析軟件沒有直接給出遷移時間數值,需要人工查找;其次如上述工作原理所示,電泳結果的定性依據是片段長度而非遷移時間,軟件依據片段的遷移時間進行曲線擬合計算出片段長度,然后根據片段長度值進行分型,最終的輸出結果是片段長度值和基因分型,遷移時間只是其中的一個過程值,因此GA118系列遺傳分析儀的校準采用片段長度作為定型測量重復性參數。根據每個法醫(yī)DNA實驗室常用的檢案試劑盒,如現(xiàn)在實驗室常用的AB公司的ID Plus、VerifilerTMP lus,Promega公 司 的PowerPlex 21、Qiagen公司的Investigator 24plex等(采用的試劑盒均應通過GA認證),用試劑盒中的Ladder作為標準品,每個泳道連續(xù)電泳5次,選擇試劑盒中最大長度Ladder,如VerifilerTMP lus中的Penta E基因座中的最后一個分型26作為定性測量重復性樣本,數據分析時任選一個樣本作為分析用Ladder,其余均作為樣本進行分析,得出每次電泳后的片段長度值,以各泳道中該片段長度相對偏差最大值作為儀器定性測量重復性,如圖7和表1所示。

    ?

    (3)定量測量重復性:同樣取實驗室常用試劑盒中最大長度Ladder的5次電泳峰面積計算相對偏差,以各泳道最大值作為儀器定量測量重復性。

    (4)泳道差異:《校準規(guī)范》中泳道差異與定量測量重復性均采用標準片段的峰面積進行計算,但《校準規(guī)范》中計算公式表述不清晰,GA118系列遺傳分析儀的校準采用如下公式計算泳道差異:

    式中:

    δ泳道差異——泳道差異;

    Xi——第i個泳道的定量測量重復性;

    ——n個泳道的定性測量重復性平均值;

    i——泳道序號;

    n——泳道數。

    同樣取實驗室常用試劑盒中最大長度Ladder的峰面積進行計算。

    (5)檢測限:以擴增試劑盒中的陽性對照作為樣本,以PowerPlex 21試劑盒為例,陽性對照2800M的濃度為10ng/μl,擴增時進行稀釋以保證加入到擴增體系中的DNA 含量為0.5ng,采用25μl擴增體系則其濃度為0.02ng/μl,配置上樣緩沖液連續(xù)電泳三次,以基因座中最低的樣本峰高按以下公式計算:

    式中:

    Di——第i個泳道的檢測限;

    HNi——第i個泳道的噪聲峰高,RFU;

    ρ ——樣本濃度;

    ——第i個泳道的樣本峰高平均值,RFU;

    i——泳道序號。

    取最大的Di作為儀器的檢測限,合成相對不確定度和相對擴展不確定度按《校準規(guī)范》中給出的方法計算,樣本濃度引入的不確定度按下式計算:

    相對擴展不確定度計算:Ur=kucr(k=2);

    (6)分辨力:儀器的分辨力是指儀器對不同長度DNA片段的區(qū)分能力,在法醫(yī)STR分型和測序應用中,要求儀器能夠正確區(qū)分長度相差1bp的DNA片段,分辨力用如下公式計算:

    式中:

    Rs——分辨力;

    P1——第1個峰的出峰時間(最大值),數據幀(pts);

    P2——第2個峰的出峰時間(最大值),數據幀(pts);

    W1——第1個峰的半峰寬;數據幀(pts);

    W2——第2個峰的半峰寬,數據幀(pts)。

    若相差1bp的兩個片段按上述公式計算,Rs≤1表示儀器可以正確區(qū)分相差1bp的兩個片段,兩個片段長度最小只能相差1bp,分析軟件如果能正確識別標準品中相差1bp的兩個片段,表明儀器的分辨率達到了1bp的分辨力。由于半峰寬的測量十分困難和繁瑣,在GA118系列遺傳分析儀的校準中對于儀器分辨力的校準不進行具體計算,只給出是否滿足1bp的結論,通過實驗室常用試劑盒中Ladder的5次電泳結果,檢查其中相差1bp的所有片段是否能被儀器正確識別,給出是否滿足1bp分辨力的結論。

    (三)校準項目及校準方法

    Ga118系列遺傳分析儀校準項目及方法如下:

    (1)外觀及功能檢查:被檢儀器外觀應整齊、清潔,表面涂、鍍層應無明顯剝落、擦傷、露底及污垢;所有緊固件不應松動,各種調節(jié)件應靈活、功能正常;可拆部分應能無障礙拆裝;所有銘牌及標志應耐久和清晰。

    (2)主要部件性能指標檢查:自動進樣器定位精度、激光器功率、電泳高壓輸出精度、恒溫箱溫控精度,按使用說明書要求進行。

    (3)空間校正:按使用說明書要求進行。

    (4)光譜校正:按使用說明書要求進行。

    (5)儀器參數:采用實驗室常用試劑盒配置校準用樣本如下:一組空白樣本,電泳一次用于校準基線漂移和基線噪聲;一組Ladder樣本連續(xù)電泳5次用于校準定性測量重復性、定量測量重復性、泳道差異和分辨力;一組擴增后的陽性對照樣本連續(xù)電泳三次用于校準儀器檢測限。

    (6)數據記錄及處理:實驗結束后進行數據分析并按《校準規(guī)范》中參考格式進行原始數據記錄,按上述校準參數中的計算方法得出校準結果并按表2所示記錄結果。

    ?

    三、結語

    遺傳分析儀作為法庭科學DNA實驗室中的大型精密分析儀器,其檢測結果主要應用于偵查破案和庭審證據,是目前進行個體識別和親子鑒定最準確的技術手段,長期以來其計量校準一直缺乏統(tǒng)一的規(guī)范,此次《校準規(guī)范》的發(fā)布實施解決了該類型儀器計量校準的難題,為實驗室的資質認定、能力認可提供了校準依據,推動了實驗室管理的規(guī)范化、標準化。本文在《校準規(guī)范》的基礎上,結合自研GA118系列遺傳分析儀的工作原理和實驗室實際應用需求,研究了科學規(guī)范、操作簡單的校準方法,在實際應用中取得了良好的效果。

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