朱砂根組織培養(yǎng)研究進展※

●許穎妍 林 臻（廈門市園林植物園 福建 廈門 361000）

朱砂根（Ardisia crenataSims），紫金?？谱辖鹋僦参?，在我國西藏東南部、湖北、海南等地區(qū)均有分布。據(jù)《本草綱目》《嶺南采藥錄》《中國藥典》等記載，朱砂根具有治療咽喉腫痛、祛風除濕的作用[1-2]。朱砂根大多通過種子繁殖[3-4]獲得，少量通過扦插繁殖獲得[5-6]，通過種子繁殖的植株性狀不穩(wěn)定[7]，扦插繁殖根系較弱、淺，活力較差，同時這兩種繁殖技術受時間限制，難以在短時間內(nèi)獲得大量種苗滿足市場需求，而組培能在短時間內(nèi)獲得大量長勢一致的植株，并能保持母本優(yōu)良性狀，防止品種退化，建立朱砂根組培快繁體系，也可為其性狀改良提供有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[7]。本文對朱砂根組織培養(yǎng)的研究進展進行綜述，以期為以后朱砂根組織培養(yǎng)的研究和工廠化育苗應用提供參考。

1 組織培養(yǎng)的品種及外植體的選擇

1.1 組織培養(yǎng)概況

目前，對朱砂根的研究大都是關于朱砂根的化學成分和藥理作用[1-2，8-13]，而關于組織培養(yǎng)的研究較少，國內(nèi)最早關于朱砂根組培的報道是2004年彭光天等[11]用朱砂根幼苗的不同部位作為外植體，誘導出愈傷組織；2007年劉均利[13]用朱砂外植體根莖段，建立了朱砂根組培快繁體系；2007年黃美娟等[14]用朱砂根幼嫩莖段作為材料，進行組織培養(yǎng)；2010年鄧素芳等[15]用朱砂根愈傷組織誘導分化出叢狀根；2016年胡菊等[16]用朱砂根葉片誘導出毛狀根。

1.2 外植體的選擇和滅菌

目前，朱砂根組織培養(yǎng)常用的外植體主要有帶芽莖段、葉片、種子等。黃美娟等[14]試驗表明，半木質(zhì)化的莖段為最佳外植體，試驗成活率較高。

外植體滅菌方法：75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～5 次，0·1%HgCl2溶液浸泡6～10 min，無菌水清洗4～6 次。鄧素芳等[7]為提高滅菌效果，先用75%酒精消毒30 s，后用0·1%HgCl2連續(xù)兩次消毒，分別為6 min 和2 min；陳俊暉等[17]試驗表明0·1% HgCl2比2%NaClO 更適合作為朱砂根外植體消毒劑，最佳滅菌方式為：75%酒精消毒30 s，0·1% HgCI2消毒8 min；劉均利[13]試驗表明朱砂根莖段消毒的適宜時間為HgCl2連續(xù)兩次消毒各4 min，葉片消毒的適宜時間為各3 min。

2 基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇

2.1 基本培養(yǎng)基

朱砂根組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基是MS、B5、White、1/2 MS（其中1/2MS 多用于生根培養(yǎng)）。MS 和1/2MS 比WPM 更有利于朱砂根莖段啟動[17]；孔祥海等[18]和陳俊暉等[17]的試驗均表明MS 培養(yǎng)基較適合誘導腋芽和增殖；馬明東等[19]試驗表明MS 培養(yǎng)基適合作為腋芽誘導及增殖的基本培養(yǎng)基，WPM 培養(yǎng)基的芽苗長勢最差，而1/2 MS、B5、H 培養(yǎng)基對腋芽誘導效果沒有顯著差異，但MS 培養(yǎng)基對根的誘導效果差，1/2 MS和3/4 MS 培養(yǎng)基對根的誘導沒有明顯差異，1/2 MS 和3/4 MS 培養(yǎng)基較適合誘導朱砂根組培苗生根。

2.2 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)選擇

朱砂根組織培養(yǎng)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、IBA、KT。初代培養(yǎng)中常使用的植物激素有6-BA、NAA，而6-BA、NAA、KT 常用于朱砂根腋芽增殖，IBA 常用于朱砂根組培苗生根。

2.2.1 愈傷組織誘導和分化朱砂根組培中誘導出的愈傷組織有兩種類型，一種可用于細胞培養(yǎng)，為乳白色或淡黃色，濕潤、疏松的愈傷組織；另一種可用于分化培養(yǎng)，為白色、淡紅色或青綠色，干燥、致密的愈傷組織。劉均利[13]試驗表明添加了2,4-D 的培養(yǎng)基，較易誘導出愈傷組織，愈傷組織最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2·0 mg/L 2,4-D +0·5 mg/L NAA+ 0·2 mg/L 6-BA，愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0·2 mg/L 6-BA + 0·2 mg/L NAA +0·5 mg/L 2,4-D。侯欣躍等[20]試驗表明，朱砂根的莖段適合誘導愈傷組織，誘導時間短且褐化少，得到的愈傷組織分裂能力強，長勢好。

2.2.2 不定芽的誘導和增殖6-BA、NAA 最常用于腋芽誘導與增殖，劉均利[13]試驗表明：腋芽誘導培養(yǎng)，初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0·5 mg/L 6-BA+0·1 mg/L NAA，最佳增殖培養(yǎng)基配方為MS+2·0mg/L 6-BA +0·1mg/L NAA+0·5 mg/L KT；陳俊暉[21]試驗表明：初代培養(yǎng)基為MS+1·0 mg/L 6-BA+0·2 mg/L NAA，誘導率達82·32%，繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1·0 mg/L 6-BA+0·2 mg/L NAA+0·1 mg/L TDZ，增殖系數(shù)達4·27；侯欣躍等[20]試驗表明：MS+1·0 mg/L 6-BA+0·1 mg/L NAA 適合朱砂根試管苗繼代誘導側(cè)芽生長，側(cè)芽誘導率達88·42%。

2.2.3 生根培養(yǎng)生根階段常以1/2 MS 為基礎培養(yǎng)基，IBA 最常用于生根培養(yǎng)。劉均利[13]試驗表明，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0·2 mg/L IBA，添加0·2%的活性炭可促進根的生長，提高生根率、生根數(shù)。陳俊暉[21]試驗表明，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0·2 mg/L IBA+1·0mg/L NAA。當IBA濃度達到1 mg/L 時，生根率降低，IBA 濃度在0·2～0·5 mg/L 之間誘導生根效果最好[19]。

朱砂根的藥用成分多集中在根上，鄧素芳等[15]利用愈傷組織分化根，試驗表明淡黃色顆粒狀愈傷組織為最適宜的試驗材料，弱光有利于愈傷組織分化根，1/2 MS 可誘導愈傷組織分化出叢狀根。

3 培養(yǎng)條件

試驗中的培養(yǎng)基無特殊標明均附加30 g/L蔗糖、6 g/L 瓊脂粉，pH 值5·8 左右，121℃下滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度23～27℃，光強1900～1500 lx，光照時間12 h/d。愈傷組織處于低和高的光照度時增殖系數(shù)都較高，在光照強度為200～1000 lx 時愈傷組織褐化程度高于遮光和強光，在遮光狀態(tài)下愈傷組織的生長量達到最大，遮光條件有利于愈傷組織細胞生長及保持松散、生長旺盛的狀態(tài)[22]。

4 組培苗的移栽

根長到2 cm 左右時煉苗，可采用兩種煉苗法：煉苗室煉苗和溫室煉苗。為提高移栽成活率，煉苗時需控制溫度濕度，同時定期噴灑殺菌液與營養(yǎng)液。朱砂根喜透氣的土壤，組培苗在河沙∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1，或蛭石∶珍珠巖=1∶1，成活率在80%以上[13，19]。

5 問題與展望

國內(nèi)朱砂根的組培有一定的研究基礎，但還沒形成一個比較完整的技術體系，還沒真正投入生產(chǎn)，主要原因有4 個：第一，外植體滅菌難，接種污染率高；第二，增殖系數(shù)低，且組培苗生長緩慢；第三，試驗材料容易產(chǎn)生褐變；第四，生產(chǎn)中朱砂根苗常出現(xiàn)畸形，如莖基部結(jié)瘤，莖尖生長點和葉腋處也會產(chǎn)生瘤狀組織，導致莖上段或頂芽不生長的現(xiàn)象。這些問題都是朱砂根工廠化育苗的瓶頸，針對外植體污染率高的問題，可對外植體進行預處理，選擇健壯的植物在合適的時間段采集外植體，也可在培養(yǎng)基中加入抗生素等抗菌劑；針對增殖系數(shù)低的問題，可以選擇合適的植物生長調(diào)節(jié)劑以及調(diào)整激素濃度，也可在培養(yǎng)基中加入朱砂根葉片勻漿物，可縮短芽苗恢復生長的時間[7]，如在需要進行朱砂根的轉(zhuǎn)基因技術研究時，可通過培養(yǎng)基優(yōu)化和改變培養(yǎng)條件等方法建立高效愈傷組織再生體系；針對容易褐變的問題，可減少外植體消毒時間、調(diào)整光照強度，也可在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑等；針對組培苗常出現(xiàn)畸形的問題，可通過調(diào)控外源激素來解決[7]。

此外，市場上的朱砂根新品種大都是通過栽培變異和雜交育種得到的，育種方法單一，且獲得新品種需要很長時間。江香梅等[23]采用RAPD分子標記技術對5 個群體的朱砂根遺傳多樣性進行檢測，試驗表明朱砂根群體在DNA 水平上存在著豐富的遺傳多態(tài)性，且群體內(nèi)的基因多樣性高于群體間的基因多樣性；鄧素芳等[24]利用RAPD 對23 份朱砂根材料進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明朱砂根資源的遺傳變異大、遺傳多樣性高；袁德義等[25]以朱砂根為材料，建立了適合于朱砂根的穩(wěn)定的ISSR 反應體系。利用分子標記技術在朱砂根上的研究與應用，以及朱砂根蘊含豐富的基因資源和復雜的遺傳背景，可進一步開展朱砂根分子育種研究工作。目前還未見關于使用誘變技術培育朱砂根新品種的報道，可先通過組織培養(yǎng)技術進行大規(guī)模的種苗繁殖，得到長勢一致的種苗作為試驗材料，再結(jié)合物理誘變和化學誘變進行朱砂根新品種的選育。同時，也可利用轉(zhuǎn)基因技術對植物性狀進行改良，培育出具有優(yōu)良性狀的新品種。