基于雙熒光中心碳量子點的比率型熒光探針快速檢測樂果

呂春秋， 司露露， 盤釗金， 梁楊琳， 廖秀芬， 陳叢瑾*

1. 南寧海關技術中心， 廣西 南寧 530021 2. 廣西大學化學化工學院， 廣西石化資源加工及過程強化技術重點實驗室， 廣西 南寧 530004

引 言

有機磷農(nóng)藥的主要作用是控制病蟲危害以及抑制雜草生長， 憑借其容易使用、 藥效持久、 容易被水、 酶及微生物降解、 殘留毒性小等優(yōu)點逐步取代了有機氯農(nóng)藥， 已成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用最廣泛的有機合成類農(nóng)藥。 樂果是一種中等毒性的內(nèi)吸性有機磷殺蟲、 殺螨劑， 被廣泛使用于防治多種作物上的刺吸式口器害蟲， 如蚜蟲、 葉蟬、 粉虱、 潛葉性害蟲及某些蚧類害蟲[1]， 對保證糧食安全生產(chǎn)， 推動農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展做出了巨大貢獻。 但是長期大量或不規(guī)范使用樂果， 不僅嚴重破壞生態(tài)系統(tǒng)， 還對人類的健康造成了巨大威脅。 非常有必要檢測環(huán)境中樂果的含量。 由于色譜法自帶分離功能在高檢測通量方面優(yōu)勢顯著， 特別是色譜技術耦合現(xiàn)代化的檢測器， 是目前檢測樂果的主流技術[2-4]。 然而色譜技術不僅儀器昂貴、 檢測費時， 而且對操作人員的專業(yè)水平要求較高[5-6]， 無法實現(xiàn)即時檢測， 而即時檢測手段在緊急事件的處理中顯得尤為重要。 現(xiàn)有基于生物技術構建的快速檢測方法， 則需要進口試劑盒， 存在原材料獲取困難等問題， 雖然大多數(shù)快速檢測方法的經(jīng)濟成本低， 但是研究耗時長， 并且大部分快速檢測方法只能實現(xiàn)特異性檢測， 短時間內(nèi)難以得到推廣使用。 依然需要開發(fā)一種簡單、 快捷、 廉價、 靈敏的方法應用于樂果的快速檢測。

近年來， 比率型熒光探針因其具有高靈敏度、 操作簡單、 對目標物的響應時間短等優(yōu)勢， 在農(nóng)藥殘留的檢測中備受關注[7]。 該法同時關注兩個不同熒光團的信號變化， 對兩個信號進行歸一化處理或者以它們的比值作為輸出信號， 相當于引入了一個內(nèi)標。 可以在一定程度上消除儀器噪音和環(huán)境的干擾， 提高方法的準確度[8]。 由于比率型熒光探針需要同時關注兩個以上的熒光信號變化， 常規(guī)的做法是同時引入兩個不同的熒光團[9-10]。 同時引入兩個熒光團構建比率型熒光傳感器的策略是可行的， 但是引入不同的熒光團無疑增加了實驗的操作， 且引入的不同熒光團可能會相互拮抗， 影響彼此的熒光效果[11]。 針對單一熒光團的比率型熒光探針將更具優(yōu)勢。

以木糖為碳源， NH4HCO3為氮源， 在180 ℃條件下進行水熱反應4 h制備摻雜氮的碳量子點(N-doped carbon quantum dots, N-CQDs)。 所制備N-CQDs的激發(fā)光譜可知， 其在238和330 nm各具有一個熒光中心， 其熒光發(fā)射中心則重疊于402 nm左右。 通過實驗發(fā)現(xiàn)， N-CQDs在238 nm激發(fā)的發(fā)射光譜， 能對樂果濃度的變化做出靈敏反應， 而在330 nm激發(fā)的發(fā)射光譜沒有明顯的變化。 利用這兩個不同熒光中心對樂果的不同熒光響應， 建立新型比率型熒光探針， 應用于樂果的檢測。 為提高檢測結果的準確性， 對測量條件進行優(yōu)化， 并詳細討論了方法的線性范圍、 檢出限、 選擇性、 精密度和準確度等檢測性能。 該方法無需酶標記， 簡單廉價， 且能在1 min內(nèi)對樂果作出響應， 反應迅速， 為緊急事件處理時農(nóng)藥殘留的即時檢測提供技術支撐， 并為其他比率型熒光探針的構建提供了新的策略。 基于N-CQDs不同熒光中心對樂果的不同熒光響應建立的比率型熒光探針還未見報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JJ324BC型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)； DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海聚宏儀器設備有限公司)； RF5301型熒光分光光度計(島津， 日本)； HITACHI型紫外-可見光記錄分光光度計(日立， 日本)； phs-3c型pH計(上海雷磁)； UP-FD-1PF型立式冷凍干燥機(上海優(yōu)普實業(yè)有限公司)； TRACE 1300-TSQ 9000型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific， 美國)； JEM-F200型透射電子顯微鏡(JOEL， 日本)； ESCALAB 250 Xi型X射線光電子能譜儀(Thermo fisher Scientific, 美國)； Nicolet iS10型傅里葉紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)。

農(nóng)藥標準溶液(樂果、 氨唑磷、 特丁硫磷、 甲草胺、 甲基硫環(huán)磷、 噻蟲胺、 甲奈胺、 乙酰甲胺磷、 甲基對硫磷、 敵百蟲、 伏殺磷， 濃度均為100 μg·mL-1)購自中國農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究所； NH4HCO3、 HCl、 NaOH(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司； 月桂酸、 十二烷基苯磺酸鈉、 聚乙二醇、 聚乙烯醇購自阿拉丁試劑(上海)有限公司； CaSO4、 MgSO4、 KCl、 Na2CO3、 Al(NO3)3購自成都金山化學試劑有限公司。

1.2 N-CQDs的合成

N-CQDs的合成參考Liao等工作并稍作修改[12]。 將0.2 g木糖和1.5 g 碳酸氫銨溶于10 mL去離子水中， 室溫下超聲攪拌均勻， 然后轉(zhuǎn)移至100 mL的聚四氟乙烯高壓反應釜中， 于180 ℃的烘箱中反應4 h。 反應完成后待反應釜冷卻至室溫， 用0.22 μm的濾膜過濾， 收集濾液后用透析袋(1 000 Da)透析24 h， 將制備好的N-CQDs于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基于單一量子點的樂果快速檢測比率型熒光傳感器構建

在若干只干凈的10 mL 比色管中加入30 μL N-CQDs， 150 μL 月桂酸， 1 μg·mL-1的樂果標準品(10， 20， 30， 50， 100， 150， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800和900 μL)， 用pH為6的去離子水(HCl調(diào)至)定容至 5 mL， 搖勻。 然后用LS55型熒光分光光度計分別測量其在激發(fā)波長λex為238和330 nm的熒光發(fā)射光譜， 記錄熒光強度， 用(I330/I238)-(I330/I238)0來表示樂果對N-CQDs的猝滅效果(狹縫寬度： Ex=3， Em=5)。

1.4 實際樣品處理

實際樣品的處理根據(jù)NY/T 761—2008[13]進行， 并稍作修改。

提?。?稱取10 g火龍果勻漿， 分別加入0， 20， 100和500 μL的10 μg·mL-1樂果標準溶液(每個加標濃度進行3次平行實驗)， 20 mL的乙腈， 充分攪拌2 min后用濾紙進行過濾， 收集約16～20 mL濾液裝到50 mL離心管中， 并加入約2.4 g氯化鈉， 蓋上塞子， 劇烈震蕩2 min， 在室溫下靜置0.5 h， 使水和乙腈分離。

凈化： 用移液槍移取10 mL的乙腈溶液至100 mL的燒杯中， 將燒杯放置在80℃的水浴鍋中加熱， 并往燒杯緩緩通入空氣流， 在蒸發(fā)掉大部分液體后， 加入2 mL的甲醇， 并將液體轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中， 再用約3 mL的甲醇沖洗三次燒杯， 將洗滌液收集至離心管中， 最后定容至5 mL， 并充分搖勻， 于4 ℃冷藏備用。 如定容后的溶液比較渾濁， 可用0.2 μm的濾膜過濾。

1.5 實際火龍果樣品檢測

采用1.3節(jié)構建的比率型熒光傳感器對實際火龍果樣品進行檢測， 取100 μL的1.4節(jié)中的處理液， 并根據(jù)1.3節(jié)， 計算回收率和相對標準偏差(RSD)。 采用國家標準的GC-MS法對實際火龍果樣品進行檢測時， 具體操作步驟根據(jù)國家標準GB 232000.8—2016[14]進行， 同時進行加標回收實驗并計算回收率和RSD。

2 結果與討論

2.1 N-CQDs的表征

為了探究N-CQDs的光學性能， 分別測定了N-CQDs的吸收光譜， 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜， 結果如圖1(d)所示。 N-CQDs在270和310 nm處出現(xiàn)了并肩吸收峰， 分別對應π—π*共軛的sp2碳核和n—π*共軛官能團[15]。 N-CQDs的激發(fā)光譜表明， 其在238和330 nm處各具有一個熒光中心。 無論在238 nm還是330 nm光激發(fā)下， 發(fā)射光譜中均重疊于402 nm左右。 這種雙激發(fā)-單發(fā)射現(xiàn)象可能歸因于其兩個熒光中心的超共軛。 對于238 nm的激發(fā)中心， 其stokes位移為164 nm。 此外， 由圖1(d)的插圖可以看出， 所制得的N-CQDs在自然光下為淡黃色液體， 而在365 nm紫外光照下發(fā)出明亮的藍色熒光。

圖1 (a) N-CQDs的TEM圖(插圖： N-CQDs的粒徑分布)； (b) N-CQDs的XRD圖譜； (c) N-CQDs的FTIR； (d) N-CQDs的UV-Vis光譜a、 熒光激發(fā)光譜b和熒光發(fā)射光譜(c: λEx=238 nm; d: λEm=330 nm； 插圖： N-CQDs在自然光和365 nm紫外燈下的圖片F(xiàn)ig.1 (a) TEM image of N-CQDs (Inset: Sizes distribution of N-CQDs); (b) XRD pattern of N-CQDs; (c) FTIR spectrum of N-CQDs; (d) UV-Vis spectrum a, fluorescence excitation spectrum b, and fluorescence emission spectra (c: Ex: λEx=238 nm; d: λEm=330 nm； Inset: imagines of N-CQDs under natural light and 365 nm UV light) of N-CQDs

2.2 樂果對N-CQDs的作用及可能的機理

如圖2(a)和(b)所示， 隨著樂果的不斷加入， 238 nm激發(fā)的發(fā)射峰其熒光被不斷猝滅， 而330 nm激發(fā)的發(fā)射峰變化不大。 探討了樂果對N-CQDs可能的熒光猝滅機理。 由圖2(c)可知， 樂果的紫外吸收光譜與N-CQDs的熒光發(fā)射光譜基本無重疊， 因此可以排除熒光共振能量轉(zhuǎn)移和內(nèi)濾效應。 采用Stern-Volmer方程[16]來判斷猝滅類型， 其方程如式(1)所示

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0和F分別為加入猝滅劑前后熒光團的熒光強度；Ksv為熒光猝滅常數(shù)； [Q]為猝滅劑的濃度；Kq為猝滅速率常數(shù)；τ0為熒光團的熒光壽命， 取τ0=10-8s。 對于靜態(tài)猝滅， 熒光團與猝滅劑之間發(fā)生相互作用， 產(chǎn)生不可逆的非熒光基態(tài)絡合物從而使得發(fā)射光譜的熒光強度降低，Ksv隨著溫度的升高而降低； 動態(tài)猝滅主要由于分子間的碰撞而導致， 猝滅劑與熒光團之間沒有復合產(chǎn)物生成， 隨著溫度升高，Ksv增大。 圖2(d)為293， 303和313 K下樂果對N-CQDs在238 nm光激發(fā)下發(fā)射光譜的熒光猝滅曲線。 在這三個溫度下，Ksv分別為5.14×105， 3.94×105和3.65×105L·mol-1， 對應的Kq分別為5.14×1013， 3.94×1013和3.65×1013L·mol-1·s-1。Ksv隨溫度的升高而降低， 并且Kq值也遠大于各類猝滅劑的最大猝滅速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)， 因此樂果對N-CQDs猝滅機理可歸為靜態(tài)猝滅。

根據(jù)參考文獻[12， 17]， N-CQDs的238 nm處熒光來自于π—π*共軛的sp2型碳核， 而330 nm處的熒光則主要來自于n—π*共軛的表面官能團。 由此可見， 樂果主要作用于sp2型碳核。 根據(jù)Zeta電位測試結果， N-CQDs的Zeta電位為-12.03 mV， 表明其表面主要覆蓋了大量的—OH和—COOH官能團， 這些官能團在水中水解產(chǎn)生負電荷。 樂果的Zeta電位為-3.37 mV， 決定了它不會與具有相同負電荷的N-CQDs官能團反應。 而樂果和N-CQDs混合物的Zeta電位為-16.07 mV， 說明樂果與N-CQDs帶正電荷的基團發(fā)生反應。 CQDs的碳核主要由石墨型碳(sp2結構)和無序的sp3碳組成， 氮的摻雜使得部分sp2碳被氮所取代， 這些氮以吡啶氮、 吡咯氮和“石墨型”氮的形式存在， 在水中解離使得它們帶上正電荷， 為具有負電荷的樂果提供了結合位點。 反應形成N-CQDs—樂果基態(tài)復合物， 導致sp2碳的電子結構破壞， 最終使238 nm激發(fā)的熒光猝滅以及混合體系的負電荷上升。 N-CQDs與樂果的反應機理如圖2(e)所示。

圖2 (a) 0～180 ng·mL-1樂果對N-CQDs 238 nm熒光中心的猝滅； (b) 0～180 ng·mL-1樂果對N-CQDs 330 nm熒光中心的猝滅； (c) 樂果的吸收光譜和N-CQDs的熒光發(fā)射光譜； (d) 不同溫度下樂果猝滅N-CQDs的Stern-Volmer曲線； (e) 樂果猝滅N-CQDs熒光的可能機理Fig.2 (a) Fluorescence quenching of 238 nm fluorescence center of N-CQDs by dimethoate in the concentration range of 0～180 ng·mL-1; (b) Fluorescence quenching of 330 nm fluorescence center of N-CQDs by dimethoate in the concentration range of 0～180 ng·mL-1; (c) Absorption spectrum of dimethoate and the fluorescence emission spectra of N-CQDs; (d) Stern-Volmer curve between dimethoate and N-CQDs under different temperature; (e) Possible fluorescence quenching mechanism of N-CQDs by dimethoate

2.3 實驗條件優(yōu)化

以238 nm激發(fā)光測得的發(fā)射光譜作為響應信號， 330 nm激發(fā)光測得的發(fā)射光譜為參比信號， 以加入樂果前后兩發(fā)射光譜熒光強度的比值的差值[(I330/I238)-(I330/I238)0]為相應信號， 構建比率型熒光探針。 為了提高N-CQDs對樂果檢測的靈敏度， 對反應溶劑條件， N-CQDs的用量， 反應時間進行優(yōu)化。 樂果具有較強的疏水性， 為了提高其在水溶液中的溶解度， 進而提高其與N-CQDs的反應效率， 首先考察了不同類型表面活性劑及其用量的影響。 實驗結果表明， 當月桂酸的濃度為3 μg·mL-1時， 獲得最大的[(I330/I238)-(I330/I238)0]值。 考察了不同pH的影響， 最佳pH為6。 還考察了不同N-CQDs用量的影響， 結果表明當加入30 μL的N-CQDs時獲得最佳的實驗效果。 響應時間及其穩(wěn)定性是評判一個新方法的重要指標。 如圖3(a)和(b)所示， N-CQDs與樂果之間的響應在1 min內(nèi)可完成， 并且在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定不變。 說明， 所建立的熒光探針具有響應速度快、 穩(wěn)定性強等特點， 在樂果的快速檢測中具有潛在的應用價值。

圖3 0.5～60 min內(nèi)40 ng·mL-1樂果對N-CQDs的238 nm熒光中心(a)和330 nm熒光中心(b)的熒光猝滅圖Fig.3 Fluorescence quenching of the N-CQDs fluorescence centers at 238 nm (a) and 330 nm (b) by 40 ng·mL-1 of dimethoate in 0.5～60 min

2.4 標準曲線的建立

當樂果濃度為2～180 ng·mL-1時， N-CQDs在238 nm激發(fā)的發(fā)射峰被有效猝滅， 而在330 nm激發(fā)的發(fā)射峰則變化較小， 因此以238 nm激發(fā)的熒光峰為響應信號， 330 nm激發(fā)的熒光峰為參比信號， 建立基于單一碳量子點不同熒光中心的比率型熒光傳感器用于樂果的快速檢測。 如圖4所示， (I330/I338)-(I330/I238)0與樂果濃度在2～100和100～180 ng·mL-1范圍內(nèi)時線性關系良好。 獲得的回歸方程分別為：y=0.043ρ-0.19和y=0.081ρ-4.11(其中，y為(I330/I238)-(I330/I238)0的值；ρ為樂果的濃度， ng·mL-1)， 對應的相關系數(shù)r分別為0.996 0和0.998 9， 檢測限為0.67 ng·mL-1(3δ/k)。

圖4 樂果的標準曲線Fig.4 Standard curve of dimethoate

2.5 共存物質(zhì)對體系的影響

圖5 (a) 常見陰陽離子及其他農(nóng)藥對N-CQDs熒光比率變化值(I330/I238)-(I330/I238)0的影響， a～u分別為a: 樂果， 氯唑磷， n: 特丁硫磷， o: 甲草胺， p: 噻蟲胺， q: 甲奈胺、 r: 乙酰甲胺磷， s: 甲基對硫磷， t: 敵百蟲， u: 伏殺磷； (b) 常見陰陽離子及其他農(nóng)藥存在下N-CQDs對樂果選擇性的影響， 其中a為樂果， b—u分別為樂果加上述干擾物Fig.5 (a) The effect of common ions and pesticides to the fluorescence ratio change (I330/I238)-(I330/I238)0 of N-CQDs, a～u represent to a: dimethoate, b: Ca2+, c: d: Mg2+, e: K+, f: Cl-, g: Na+, h: j: Al3+, k: m: clozophos, n: terbufos, o: alachlor; p: clothianidin, q: α-naphthylamine, r: orthene, s: parathion-methyl, t: dipterex, u: phosalone, respectively； (b) The effect of common ions and pesticides to the selectivity of the constructed dual fluorescence center based dimethoate probe, a represents to dimethoate, and b—u represent to the mixture of dimethoate and the interfering substances mentioned above, respectively

2.6 火龍果樣品中樂果的檢測

為研究該檢測方法在實際樣品檢測中的應用性能， 將其應用于火龍果中的樂果檢測， 并進行了加標回收實驗， 每個水平的加標回收實驗進行3個平行試驗。 通過測量回收率來估計準確度， 通過計算3個平行實驗結果的RSD來估計精密度。 為了能更好地評價方法的檢測性能， 還將所建立的方法與國家標準的GC-MS法進行對比試驗。 實驗結果如表1所示。 所建立的比率型熒光探針在火龍果檢測時的回收率在92.55%～102.24% 之間， RSD在2.28% ～3.62%(n=3)之間。 而GC-MS的回收率在84.22%～100.64%之間， RSD在2.95%～10.95%之間。 與GC-MS法相比， 所建立的實驗方法獲得更高的準確度(回收率)和精密度(RSD)。 值得一提的是， 當樣品中樂果的加標量為4.0 ng·mL-1時， GC-MS法無法識別， 而所建立的熒光比率分析法仍可識別， 回收率為102.24%， RSD為3.62%， 說明所建立的方法比國家標準規(guī)定的GC-MS法具有更高的靈敏度。 此外， 本方法在1 h內(nèi)可完成所有樣品的檢測， 而GC-MS法則需要10 h左右的檢測時間， 說明本研究所建立的方法更加快捷。

表1 火龍果中樂果殘留量的檢測Table 1 Determination of dimethoate residues in pitaya

3 結 論

利用N-CQDs的不同熒光發(fā)射中心構建了比率型熒光傳感器用于測定有機磷農(nóng)藥樂果含量。 在優(yōu)化的實驗條件下， 樂果的線性檢測范圍為2～180 ng·mL-1， 檢測限為0.67 ng·mL-1(3δ/k)。 常見的干擾物質(zhì)和其他類型的有機磷農(nóng)藥對樂果檢測影響不大， 方法選擇性好。 將所構建的方法用于火龍果中樂果的檢測， 回收率在92.55%～102.24%之間， RSD在2.28%～3.62%(n=3)之間。 國標GB 232000.8—2016所規(guī)定的GC-MS法回收率在84.22%～100.64%之間， RSD在2.95%～10.95%之間。 與GC-MS法相比， 所建立的檢測方法獲得了更高的準確度(回收率)和精密度(RSD)。