桑枝不同部位超高效液相特征圖譜建立及化學(xué)模式識別研究

鄧?yán)罴t，陳仕妍，王壽富，林偉雄，張雪蘭，邱彩月，黃貴發(fā)，張正

（1.廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244；2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528244）

桑枝始載于《本草圖經(jīng)》[1]，為桑科桑屬植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝，味微苦，性平，入肝經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)功效，可治療風(fēng)濕痹病、肩臂、關(guān)節(jié)酸痛麻木等癥，臨床上常用于治療肩臂關(guān)節(jié)腫痛、四肢痙攣和肌體風(fēng)癢等疾病[2-3]。桑枝的資源非常豐富，在全國各地均有分布，但主產(chǎn)于浙江、安徽、江蘇、湖南等地[4]，一般春末夏初采收，呈長圓柱形，少有分枝，長短不一，從結(jié)構(gòu)上可分為木質(zhì)部和韌皮部兩部位，各約占全桿桑枝的72%、27%，另髓芯部約占1%[5]?，F(xiàn)代研究表明，桑枝主要含有黃酮類、生物堿類、木質(zhì)素類、果膠類、多糖類等化學(xué)成分[6-8]，不同部位化學(xué)成分差異較大，如木質(zhì)素和多糖類在木質(zhì)部中的含量占比略高，而韌皮部中則含有較多的果膠類成分[9]。為進(jìn)一步探究桑枝不同部位的化學(xué)成分差異，彌補(bǔ)《中國藥典》2020 年版桑枝項(xiàng)下僅有性狀和顯微鑒別，而無相關(guān)化學(xué)成分定性定量分析的空白。本研究通過建立超高效液相色譜法，獲得桑枝及其不同部位全面系統(tǒng)的超高效液相特征圖譜，運(yùn)用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析等化學(xué)模式識別方法對超高效液相特征圖譜中的多指標(biāo)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，深入研究桑枝不同部位主要特征性成分的差異，對完善桑枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂及今后桑枝資源綜合開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ME204E 型、XP26 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機(jī)（德國Merck 有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑皮苷A 對照品（純度≥98%，批號18052901，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；綠原酸對照品（純度：96.30%，批號110753-202119，購自中國食品藥品檢定研究院）；隱綠原酸對照品（純度：99.30%，批號DST220104-035，購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司）；乙腈為色譜級（默克公司），其余試劑為分析純，水為超純水。10 批桑枝藥材（編號S1-S10）經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為桑科植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝，來源信息詳見表1。將10 批桑枝藥材不同部位分開，分別得木質(zhì)部芯桿（編號G1-G10）、韌皮部皮（編號P1-P10）。

表1 10批桑枝來源信息Table 1 Source information of 10 batches of Ramulus Mori

2 方法與結(jié)果

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%磷酸，梯度洗脫（0～2 min，9%～13%A；2～6 min，13%～14%A；6～7 min，14%～23%A；7～18 min，23%～40%A；18～19 min，40%～68%A；19～20 min，68%～9%A）；檢測波長：320 nm；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定桑皮苷A、綠原酸、隱綠原酸對照品，加50%甲醇制成每1 mL分別含86.05 μg桑皮苷A、98.90 μg綠原酸、88.48 μg隱綠原酸的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取桑枝樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）處理15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，采用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度考察 取桑枝藥材粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測樣品，重復(fù)進(jìn)樣6 次，以2 號峰桑皮苷A為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對保留時(shí)間（RRT）和相對峰面積（RPA）的RSD均小于3%，提示儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取桑枝藥材粉末適量，平行6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測樣品，以2 號峰桑皮苷A 為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD均小于3%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取桑枝藥材粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測樣品，以2 號峰桑皮苷A 為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD 均小于5%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 桑枝特征圖譜的建立 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備10批桑枝藥材供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，采集色譜圖，將其導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件中進(jìn)行色譜圖匹配，建立桑枝藥材的特征圖譜。以S1圖譜作為參照圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正、全譜峰匹配、中位數(shù)法生成10批桑枝藥材的共有特征圖譜及對照特征圖譜，10 批桑枝藥材共有特征圖譜中共標(biāo)定了共有峰11個(gè)，通過對照品比對，指認(rèn)了2 號峰為桑皮苷A、4 號峰為綠原酸、5 號峰為隱綠原酸，詳見圖1、2。計(jì)算10 批桑枝藥材特征圖譜與生成的共有對照特征圖譜的相似度為0.936、0.971、0.859、0.989、0.994、0.865、0.982、0.940、0.924、0.898，表明不同批次桑枝樣品間質(zhì)量一致性整體較好。

圖1 10批桑枝藥材共有特征圖譜Figure 1 Common characteristic chromatograms in 10 batches of Ramulus Mori

2.2.8 桑枝不同部位特征圖譜評價(jià) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備10批桑枝芯桿及皮兩部位的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，采集色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件中進(jìn)行色譜圖匹配，分別以G1、P1 圖譜作為參照圖譜，經(jīng)多點(diǎn)校正、全譜峰匹配生成10批桑枝芯桿及皮兩部位的共有特征圖譜，同時(shí)采用中位數(shù)法分別生成對照特征圖譜，10 批桑枝芯桿及皮共有特征圖譜中均標(biāo)定了11 個(gè)共有峰。共有特征圖譜詳見圖3，對照特征圖譜詳見圖4。

圖2 桑枝藥材對照圖譜和對照品圖譜Figure 2 Reference characteristic chromatogram of Ramulus Mori and chromatograms of mixed reference substances

圖3 桑枝芯桿（A）和皮（B）共有特征圖譜Figure 3 Common characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod(A)and bark(B)

圖4 桑枝芯桿和皮的對照特征圖譜Figure 4 Reference characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod and bark

2.3 化學(xué)模式識別分析

2.3.1 方差分析 采用SPSS 20.0 軟件對10 批桑枝藥材、芯桿和皮共有特征峰的單位峰面積（μAu*s/g）進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，芯桿的峰3、5、10，皮的峰1、2、4、5、9-11 與藥材間的單位峰面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明藥材各特征峰的含量與芯桿接近，而與皮差異較大，或與芯桿在藥材占比較大有關(guān)；芯桿的峰1-4、11 與皮間的單位峰面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即桑枝皮中峰1-4的單位峰面積顯著大于桑枝芯桿，而桑枝皮中峰11的單位峰面積則顯著小于桑枝芯桿，此外峰5、6、9、10 的單位峰面積在芯桿中含量略高，峰7、8 的單位峰面積在皮中含量略高，表明桑枝不同部位含有的化學(xué)成分存在一定差異。10 批桑枝不同部位特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結(jié)果見表2。

表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

與藥材比較：aP＜0.05；與芯桿比較：bP＜0.05

2.3.2 熱圖和聚類分析 以11 個(gè)共有特征峰單位峰面積為變量，采用對數(shù)歸一化方式，以Euclidean 平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，使用HemI 1.0軟件對10批桑枝藥材、芯桿和皮特征圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖和聚類分析。熱圖分析結(jié)果顯示桑枝藥材、芯桿和皮間化學(xué)成分含量差異較大，其中桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖，表明其所含各成分含量較藥材、芯桿高；桑枝皮9-11 共有特征峰稍偏冷，表明其所含各成分含量均較藥材、芯桿低；5～8 特征峰在桑枝藥材、芯桿和皮間顏色相近，表明其所含化學(xué)成分含量差異較??；除桑枝藥材的S8樣品與桑枝皮樣品聚在一起外，樣品聚類分析結(jié)果顯示桑枝藥材和芯桿可大致聚為Ⅰ類，桑枝皮大致聚為Ⅱ類，表明桑枝芯桿與藥材的一致性較高，且與皮區(qū)分明顯，如圖5所示。

圖5 桑枝不同部位的熱圖聚類分析圖Figure 5 Heat map and dendrogram of hierarchical cluster analysis of different parts of Ramulus Mori

2.3.3 PCA 分析 在聚類分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用主成分分析（PCA）對桑枝藥材、芯桿和皮樣品進(jìn)行比較，通過數(shù)學(xué)降維的原理，從10批桑枝藥材、芯桿和皮樣品原數(shù)據(jù)中提取幾個(gè)具代表的綜合性指標(biāo)來代替多個(gè)原始變量。PCA 分析結(jié)果中提取到4個(gè)特征值大于1 的主成分（PC），可用于反映桑枝藥材、芯桿和皮樣品特征圖譜86.08%以上信息，其中PC1 貢獻(xiàn)率為31.82%，貢獻(xiàn)率最大，PC2 貢獻(xiàn)率為27.28%，PC3 貢獻(xiàn)率為17.59%，PC4貢獻(xiàn)率為9.40%。由前3 個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，得到10 批桑枝藥材、芯桿和皮樣品的PCA得分圖（詳見圖6），由圖可見，桑枝藥材與芯桿聚為一類，桑枝皮單獨(dú)聚為一類，PCA 的整體區(qū)分與熱圖聚類分析結(jié)果一致。根據(jù)桑枝不同部位共有峰成分矩陣，主成分1的信息來自峰1、2、4、8，其中2號峰為桑皮苷A、4號峰為綠原酸；主成分2 的信息來自峰6、9、10、11；主成分3 的信息來自峰3、7；主成分4 的信息來自峰5隱綠原酸。詳見表3。

表3 桑枝不同部位成分矩陣Table 3 Composition matrix of different parts of Ramulus Mori

圖6 桑枝不同部位樣品的主成分分析得分圖Figure 6 Principal component analysis score plot of different parts of Ramulus Mori samples

以Y1，Y2，Y3、Y4 代表4 個(gè)主成分來作為10 批不同部位桑枝成分所表達(dá)的信息，建立桑枝不同部位品質(zhì)評價(jià)模型，得出如下成分的線性關(guān)系表達(dá)式分別為Y1=F1*0.906+F2*0.890+F3*0.613+F4*0.649-F5*0.043+F6*0.359+F7*0.568+F8*0.747+F9*0.049-F10*0.231-F11*0.152；Y2=F1*0.041-F2*0.040-F3*0.031-F4*0.346+F5*0.570+F6*0.541+F7*0.178+F8*0.341+F9*0.818+F10*0.828+F11*0.870；Y3=F1*0.280-F2*0.324+F3*0.710+F4*0.553+F5*0.368+F6*0.202-F7*0.672-F8*0.530+F9*0.034+F10*0.181-F11*0.008；Y4=-F1*0.222+F2*0.155+F3*0.248-F4*0.279+F5*0.691+F6*0.055+F7*0.290-F8*0.085-F9*0.488-F10*0.049-F11*0.091。結(jié)合1、2、3、4 主成分方差貢獻(xiàn)率，桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價(jià)表達(dá)式Y(jié)綜合得分=（Y1*31.82+Y2*27.28+Y3*17.59+Y4*9.40）/86.08，根據(jù)以上公式得到桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價(jià)得分及排名，排名前10的樣品中桑枝皮占了7 批，排名前20 的樣品中桑枝藥材占了7 批、桑枝皮占了9 批，表明桑枝皮的化學(xué)成分綜合質(zhì)量水平優(yōu)于桑枝藥材及芯桿，桑枝藥材綜合質(zhì)量水平則介于桑枝皮和芯桿之間。詳見表4。

表4 桑枝不同部位主成分得分及綜合得分排名Table 4 Ranking of principal component scores and comprehensive scores of different parts of Ramulus Mori

2.3.4 OPLS-DA 分析 為了進(jìn)一步明確桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志物，基于主成分分析（PCA）結(jié)果，采用監(jiān)督模式識別法進(jìn)行桑枝藥材、芯桿和皮樣品間正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），計(jì)算出對差異貢獻(xiàn)較大的因素。以模型變量投影（VIP）值為指標(biāo)對引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間差異的成分進(jìn)行分析，篩選貢獻(xiàn)較大的6 個(gè)變量（以VIP 值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)），分別為1 號峰（VIP=1.247）、10 號峰（VIP=1.171）、4 號綠原酸峰（VIP=1.134）、2 號桑皮苷A 峰（VIP=1.133）、3 號峰（VIP=1.072）和11 號峰（VIP=1.046），提示上述6 個(gè)成分是引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間成分差異的主要標(biāo)志性成分，其余峰VIP 值小于1，對樣品的區(qū)分影響較小。詳見圖7。

圖7 桑枝不同部位樣品11個(gè)共有峰的VIP值Figure 7 VIP values of 11 common peaks of different parts of Ramulus Mori

3 討論

本研究通過建立桑枝不同部位超高效液相特征圖譜，結(jié)合方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析進(jìn)行化學(xué)模式識別分析，能將桑枝芯桿與皮進(jìn)行有效地區(qū)分。方差分析結(jié)果表明桑枝不同部位所含的化學(xué)成分存在較大差異，偏水溶性成分（峰1-4）含量主要富集在桑枝皮中，偏脂溶性成分（峰9-11）含量主要富集在桑枝芯桿中，這與熱圖分析結(jié)果桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖，9-11 共有特征峰顏色偏冷相符。PCA 分析結(jié)果顯示桑枝藥材與芯桿聚為一類，桑枝皮單獨(dú)聚為一類，與熱圖聚類分析結(jié)果一致，進(jìn)一步建立桑枝不同部位品質(zhì)評價(jià)模型，表明桑枝皮的化學(xué)成分的綜合質(zhì)量水平優(yōu)于桑枝藥材及芯桿，或?yàn)樯ＶΣ煌Y(jié)構(gòu)組織上的差異導(dǎo)致主要化學(xué)成分的合成和積累不同，同時(shí)又因芯桿占藥材的絕大部分導(dǎo)致藥材質(zhì)量與芯桿相似，故在藥材采收時(shí)應(yīng)綜合考慮不同生長年限、不同直徑大小等因素下皮和芯桿主要化學(xué)成分的合成積累，另在藥材加工時(shí)也應(yīng)注意對皮部的保留以確保藥材品質(zhì)。OPLS-DA分析進(jìn)一步明確了桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產(chǎn)生差異的6 個(gè)主要標(biāo)志物，其中標(biāo)志物之一桑皮苷A為二羥基芪類化合物，又稱為氧化白藜蘆醇苷，主要存在于桑屬植物中[10-11]，在桑枝藥材中質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高，具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抑制絡(luò)氨酸酶、抗氧化活性以及逆轉(zhuǎn)耐藥活性等多種作用[12-14]，作為評價(jià)桑枝不同部位差異及藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)具有重要意義。

本研究建立的超高效液相特征圖譜和化學(xué)模式識別分析方法能較好地反映桑枝不同部位化學(xué)成分的分布規(guī)律及差異性?！吨袊幍洹?020 年版收載的桑枝來源為桑的嫩枝，規(guī)定其直徑應(yīng)為0.5～1.5 cm，但未對嫩枝的生長年限做明確的規(guī)定[2]，劉善新等[15]通過比較不同生長年限桑枝中的黃酮成分，發(fā)現(xiàn)生長時(shí)間在半年內(nèi)的桑枝，黃酮的總含量和種類均明顯少于生長時(shí)間1 年以上的桑枝，因此桑枝藥材質(zhì)量控制應(yīng)關(guān)注不同生長時(shí)期不同部位主要成分桑皮苷A 及其他化學(xué)成分的含量變化規(guī)律，同時(shí)結(jié)合藥效學(xué)及安全性評價(jià)開展進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。