基于指紋圖譜研究金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒相關(guān)性

張輝，許樹萍，黃凱偉，趙偉志，鄭曉英，譚沛

（1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518110；2.華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東惠州 516000）

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigataMichx.的干燥成熟果實(shí)，為花托發(fā)育而成的假果，呈倒卵形，切開后，花托壁厚，內(nèi)有多數(shù)堅(jiān)硬的小瘦果，內(nèi)壁及瘦果均有淡黃色絨毛[1]。金櫻子最早載于南北朝《雷公炮炙論》，在歷代本草與古籍文獻(xiàn)中，除南北朝為同名異物外，此后多以金櫻子為正名，并記載有別名。金櫻子味酸澀，性溫、平，歸脾、腎、肺、膀胱經(jīng)，具有滋補(bǔ)益氣的保健功效[2]。現(xiàn)代研究表明，金櫻子含有黃酮、三萜、鞣質(zhì)、苯丙素、甾體、多糖類等化學(xué)成分；具有收澀止瀉、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌抗炎、抗腫瘤、保肝護(hù)腎、降血脂、保護(hù)神經(jīng)等生物活性；可用于治療糖尿病腎病、慢性腎炎蛋白尿、遺精遺尿、特發(fā)性血小板減小性紫癜、慢性頑固性腹瀉等疾病[3]。金櫻子肉的炮制工藝為：取凈金櫻子，略浸，潤透，縱切兩瓣，除去毛、核，干燥，制得金櫻子肉飲片。《中國藥典》明確規(guī)定金櫻子的飲片為金櫻子肉，而非金櫻子，目前國內(nèi)臨床使用以及文獻(xiàn)報(bào)道上，對金櫻子藥材的飲片認(rèn)識(shí)存在不足，使用上存在錯(cuò)誤的情況[1]。本研究將首次對金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行研究。

目前，對金櫻子藥材和配方顆粒指標(biāo)成分含量的相關(guān)質(zhì)量控制研究報(bào)道較多，而對金櫻子肉的相關(guān)研究報(bào)告較少。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基礎(chǔ)。金櫻子肉配方顆粒是以金櫻子肉飲片為原料，經(jīng)過提取、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝等生產(chǎn)工藝加工制成供中醫(yī)臨床配方用的顆粒。本研究采用高效液相色譜法建立了金櫻子肉配方顆粒的指紋圖譜，并考察分析金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒之間的相關(guān)性和差異性，進(jìn)而有效提高金櫻子肉配方顆粒的質(zhì)控水平和整體質(zhì)量，也為金櫻子肉配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters（Alliance2695 型）高效液相色譜儀；XS204、XS205、XSE205 萬分之一天平（瑞士梅特勒）、ME36S 百萬分之一天平（瑞士梅特勒）、超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、水浴鍋。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：110831-201605，純度90.8%）、鞣花酸（批號：111959-201602，純度89.3%）對照品、金櫻子對照藥材（批號：121047-201204）均購于中國食品藥品檢定研究院；鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（批號：22012502）購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸（批號：080097-202111）購于上海鴻永生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。

15 批金櫻子藥材產(chǎn)地分別來自安徽省（A1-A3）、江西?。ˋ4-A6）、湖南省（A7-A9）、貴州省（A10-A12）、廣東?。ˋ13-A15），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)的劉守金教授鑒定為金櫻子Rosa laevigataMichx.的干燥成熟果實(shí)。15批金櫻子肉飲片（樣品編號B1-B15）嚴(yán)格按照2020 年版《中國藥典》一部金櫻子項(xiàng)下飲片炮制規(guī)定進(jìn)行炮制[1]：取凈金櫻子，略浸，潤透，縱切兩瓣，除去毛、核，干燥，制得金櫻子肉飲片。15 批金櫻子肉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（樣品編號C1-C15）嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中煎藥方法進(jìn)行制備：取金櫻子肉飲片，提取制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑，為了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的長期儲(chǔ)存，根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》，進(jìn)行低溫減壓濃縮，冷凍干燥，得金櫻子肉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。15 批金櫻子肉配方顆粒（樣品編號為D1-D15）由水提取，濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱：Waters AtlantisTMT3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0 min：3%A-97%B；35 min：25%A-75%B；40 min：40%A-60%B；檢測波長為260 nm；柱溫30 ℃）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 參照物溶液的制備

取金櫻子對照藥材約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入水50 mL，加熱回流45 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對照藥材參照物溶液。取沒食子酸、鞣花酸-4-Oα-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶液分別制成每1 mL含對照品20μg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 金櫻子肉飲片供試品溶液 取金櫻子肉飲片粉末約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入水50 mL，加熱回流45 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 金櫻子肉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉供試品溶液取金櫻子肉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.8 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 金櫻子肉配方顆粒供試品溶液 取金櫻子肉配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.8 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取陰性溶液、參照物溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1-6?？梢姽┰嚻啡芤荷V峰與參照物溶液色譜峰保留時(shí)間相對應(yīng)，且陰性溶液對供試品溶液色譜各特征峰無干擾，表明該分析方法專屬性良好。

圖1 供試品溶液（配方顆粒）和沒食子酸（峰1）、鞣花酸（峰7）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸（峰8）對照品色譜圖Figure 1 Chromatograms of test solution (formula granules) and reference substances of gallic acid(peak 1),ellagic acid(peak 7),quercetin-3-O-β-D-glucopyranosylic acid(peak 8)

圖2 供試品溶液（配方顆粒）和鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（峰6）對照品色譜圖Figure 2 Chromatograms of test solution (formula granules)and reference substance of ellagic acid-4-O-α-L-arabinoside(peak 6)

圖3 供試品溶液HPLC色譜圖Figure 3 The HPLC chromatograms of test solution

圖4 金櫻子對照藥材HPLC色譜圖Figure 4 The HPLC chromatogram of Rosa laevigata reference material

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各特征峰與參照物S 峰（7 號峰）的相對保留時(shí)間以及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.10%和0.13%～1.51%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4），按“2.3.4”項(xiàng)的供試品制備方法重復(fù)制備6份，并且按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各特征峰與參照物S 峰（7 號峰）的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.16%和2.03%～2.95%，表明該方法的重復(fù)性良好。

圖5 金櫻子對照藥材與供試品溶液HPLC色譜圖Figure 5 The HPLC chromatograms of Rosa laevigata reference material and test solutions

圖6 陰性溶液HPLC色譜圖Figure 6 The HPLC chromatogram of negative solution

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4）供試品溶液，按按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，測定各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果各色譜峰與參照物S 峰（7號峰）的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.12%和0.38%～3.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜及其參數(shù)的建立與相似度評價(jià)

2.5.1 指紋圖譜及其參數(shù)的建立 分別取15批金櫻子肉飲片、15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑、15 批配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用藥典委員會(huì)編制的指紋圖譜相似度評價(jià)軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012 版”，用15 批金櫻子肉飲片、15 批金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑、15 批金櫻子肉配方顆粒分別生成對照指紋圖譜R1、R2、R3（圖7-9）；色譜匹配之后，得到8個(gè)響應(yīng)值較合適、分離度較好、純度較高的共有特征峰（圖10-12）。通過查閱文獻(xiàn)，對金櫻子肉配方顆粒各個(gè)特征峰的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，選用沒食子酸、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸對照品對其進(jìn)行定位指認(rèn)，確定1號峰為沒食子酸，6號峰為鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷，7 號峰為鞣花酸，8 號峰為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸。

圖7 金櫻子肉飲片對照指紋圖譜Figure 7 The fingerprint of Rosa laevigata fructus

圖8 金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜Figure 8 The fingerprint of Rosa laevigata fructus standard decoction

圖9 金櫻子肉配方顆粒對照指紋圖譜Figure 9 The fingerprint of Rosa laevigata fructus formula granules

圖10 15批金櫻子肉飲片指紋圖譜Figure 10 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus

2.5.2 相似度評價(jià)研究 用藥典委員會(huì)編制的指紋圖譜相似度評價(jià)軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012 版”，將15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜導(dǎo)入并計(jì)算各批次與其對照圖譜的相似度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的指紋圖譜與其相應(yīng)對照指紋圖譜（R1、R2、R3）的相似度均大于0.95，表明不同批次金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表1 15批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜相似度結(jié)果Table 1 Results of similarity analysis of 15 batches of Rosa laevigata fructus pieces,standard decoction and formula granules

圖11 15批金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜Figure 11 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus standard decoction

圖12 15批金櫻子肉配方顆粒指紋圖譜Figure 12 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus formula granules

2.5.3 對照指紋圖譜的比較 將15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜生成的對照指紋圖譜R1、R2、R3（見圖13）分別導(dǎo)入軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012 版”，結(jié)果顯示：與金櫻子肉飲片比較，金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的相似度分別為0.991 和0.992，金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒指紋圖譜相似度為1.000，表明金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒成分基本一致，標(biāo)準(zhǔn)湯劑在提取、濃縮、干燥過程中，其成分種類無明顯變化。

圖13 金櫻子肉飲片對照指紋圖譜（R1）、標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜（R2）和配方顆粒對照指紋圖譜（R3）Figure 13 Reference fingerprints of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules by HPLC

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 共有峰相關(guān)性分析 采用SPSS 26.0 軟件，以15批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰的峰面積值為變量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見表2?？梢?，45個(gè)樣品中色譜峰峰1（沒食子酸）和峰5，峰2 和峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）均具有顯著的正相關(guān)性；峰2 和峰3、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸），峰3 和峰5、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）、峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）；峰5 和峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）、峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-L-吡喃葡糖苷酸）；峰6 和峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）均具有極顯著的正相關(guān)性。

表2 15批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果Table 2 Correlation analysis results of common peaks of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

2.6.2 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件，以15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰面積為變量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖14。可見，當(dāng)距離為10 時(shí)，45 批樣品可以分為4 類，B4-B7、B14、B15、C1-C15、D1-D3、D7-D15 聚為一類，B1-B3、B8-B11 聚為一類，D4-D6 聚為一類，B12、B13聚為一類。表明飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒三者之間無顯著性差異，且標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒更為接近。

圖14 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜聚類分析樹狀圖Figure 14 The cluster analysis tree of Rosa laevigata fructus,standard decoction,formula granules

2.6.3 主成分分析（PCA）采用SPSS 26.0 軟件，對15批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45個(gè)樣品各特征峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值（Xi）進(jìn)行主成分分析，主成分結(jié)果以特征值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)提取得到2 個(gè)主成分，計(jì)算得特征值和方差貢獻(xiàn)率見表3，主成分因子載荷矩陣見表4。由結(jié)果可知，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為72.13%，表明提取的2 個(gè)主成分能反映金櫻子肉指紋圖譜的大部分信息。主成分1的特征值為4.176，方差貢獻(xiàn)率為52.20%，載荷較高的峰有峰3、峰4、峰5、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸，表明這6 個(gè)峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.594，方差貢獻(xiàn)率為19.92%，載荷較高的峰有沒食子酸、峰2，表明這2個(gè)峰主要反映主成分2的信息。

根據(jù)表3 和表4 的數(shù)據(jù)，由公式Fi=Wi1X1+Wi2X2+…….+WijXj（W為主成分中各個(gè)變量的權(quán)重，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應(yīng)成分特征值的算術(shù)平方根所得），計(jì)算得到主成分得分F1、F2，主成分得分圖見圖15。

圖15 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜主成分得分圖Figure 15 PCA score plot of principal component analysis of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

表3 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic values and variance contribution rates of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

表4 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Table 4 Principal component factor load matrix of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

2.6.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14.1 軟件，以15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45 個(gè)樣品各特征峰峰面積為變量進(jìn)行OPLS-DA 分析，結(jié)果見圖16-17。由模型參數(shù)可知，數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X（cum）=0.460，模型區(qū)分參數(shù)R2Y（cum）=-0.005 7，模型預(yù)測參數(shù)Q2=-0.226，均符合要求，表明該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠。45個(gè)樣品可分成4類。以VIP值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）、峰3、峰2、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）是影響分類的主要標(biāo)志性成分。

圖16 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜OPLS-DA得分圖Figure 16 OPLS-DA score plot of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

圖17 金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC 指紋圖譜VIP值Figure 17 Results of VIP values of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

3 討論

本研究參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》，對制備工藝關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行考察研究。考察飲片吸水率和不同加水量，確定金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮加水量為一煎加水8 倍量和二煎加水6 倍量，并通過古文中醫(yī)藥著作和現(xiàn)代臨床的使用情況，確定標(biāo)準(zhǔn)湯劑的煎煮工藝為：冷浸30 min，煎煮兩次，一煎加8 倍量水，煎煮30 min，二煎加6 倍量水，煎煮25 min?？疾觳煌繑?shù)濾材，選擇200 目濾布作為湯劑的過濾方式。對不同濃縮溫度的影響考察，確定了減壓濃縮過程中濃縮溫度控制在55～65 ℃，并且確定真空度和濃浸膏相對密度等參數(shù)，并且采用冷凍干燥制備成金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑。為了確保顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性，配方顆粒制備工藝參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝參數(shù)保持一致。

金櫻子中主要含有多糖類、黃酮類、鞣質(zhì)等成分，本實(shí)驗(yàn)以相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[4-9]為導(dǎo)向，針對其主要成分展開指紋圖譜方法研究，通過對比不同波長的色譜圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長為260 nm 時(shí)，色譜圖基線平穩(wěn)且各特征峰響應(yīng)值較高；且考察過程中發(fā)現(xiàn)采用乙腈∶0.1%磷酸溶液流動(dòng)相洗脫、在流速1.0 mL/min和柱溫30 ℃條件下，各色譜峰分離效果最好。同時(shí)，考慮到樣品制備方法對指紋圖譜的建立影響較大，選取了純水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，選擇70%甲醇作為提取溶劑時(shí)，指紋圖譜得到的色譜峰信息量較大，峰型較好，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)相對較優(yōu)；并考察了超聲提取和加熱回流不同提取方式，結(jié)果顯示提取方式對指紋圖譜的影響較小，在此基礎(chǔ)上，考察了提取時(shí)間30～60 min，在該范圍內(nèi)，各特征成分能被完全提取，綜合考慮，選擇45 min 為提取時(shí)間。對取樣量0.4～1.0 g 進(jìn)行考察，當(dāng)金櫻子肉標(biāo)準(zhǔn)湯劑取樣量為0.8 g 時(shí)，色譜峰的響應(yīng)值相對均衡，因此，取樣量確定均為0.8 g。

本試驗(yàn)確定的金櫻子肉配方顆粒8個(gè)特征共有峰在飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜圖中均可找到對應(yīng)峰，并指認(rèn)了其中的1、6、7、8號峰，分別為沒食子酸、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸；相似度評價(jià)結(jié)果顯示，15 批金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜與相應(yīng)對照指紋圖譜的相似度均大于0.950，三者對照指紋圖譜的相似度均大于0.990；皮爾遜相關(guān)性分析檢驗(yàn)了共有峰兩兩之間的關(guān)系強(qiáng)度，表明大部分共有峰成顯著相關(guān)關(guān)系，說明金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒在化學(xué)成分類型以及成分的含量上沒有明顯的差異。主成分分析（PCA）則通過少數(shù)幾個(gè)主成分來解釋多個(gè)共有峰間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)批次間的可視化，共有峰間相關(guān)程度越高，主成分分析效果越好，結(jié)果顯示，兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.13%，金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒三者沒有明顯差異，且標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的相似度較高。聚類分析均表明三者沒有明顯的差異，但標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的質(zhì)量更為相近，說明配方顆粒制備工藝參數(shù)的合理性和穩(wěn)定性，配方顆粒生產(chǎn)制備過程中，各特征峰均能穩(wěn)定性傳遞，沒有發(fā)生明顯的降解或者增加的情況，制得的配方顆粒的質(zhì)量水平與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑基本一致。OPLS-DA 將45 個(gè)樣品分為4 類，并篩選出4 個(gè)VIP 值大于1 的差異性成分峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）、峰3、峰2、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷），目前2020 年版《中國藥典》“金櫻子”項(xiàng)下尚未有含量測定項(xiàng)目，而關(guān)于金櫻子的含量測定的報(bào)道也比較少，因此，計(jì)劃下一步從該4 個(gè)特征性成分出發(fā)，建立專屬性的含量測定方法，進(jìn)一步評價(jià)金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒含量的相關(guān)性。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，金櫻子對照藥材指紋圖譜，在特征峰的個(gè)數(shù)上與金櫻子肉指紋圖譜一致，說明了兩者在化學(xué)成分的一致，含有毛、核等部位的金櫻子對照藥材圖譜中，沒有其他明顯的特征峰的出現(xiàn)，說明了金櫻子的有效成分主要在金櫻子肉的部位，證明藥典飲片炮制中“除去毛、核”等步驟的合理性，后續(xù)將結(jié)合含量測定，進(jìn)一步對金櫻子和金櫻子肉的差異進(jìn)行深入的對比研究。

本研究采用高效液相色譜法建立金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒指紋圖譜，該方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，采用多種統(tǒng)計(jì)方法對金櫻子肉飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒三者的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明三者的相關(guān)性較好，采用該指紋圖譜技術(shù)，可以用于金櫻子肉配方顆粒生產(chǎn)制備過程中從原料到成品階段的質(zhì)量有效控制。