cAMP/PKA通路在HPV16/18相關(guān)宮頸癌中的表達(dá)情況及臨床意義

付小玲 郭 哲 許 靜

宮頸癌是一種最為常見的惡性腫瘤，是導(dǎo)致女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一。據(jù)臨床研究顯示，宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的因素較多且復(fù)雜，導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的危險(xiǎn)因素之一是人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，目前已知的與宮頸癌發(fā)生存在緊密關(guān)系的兩類高危型HPV分別為HPV16和HPV18，在99%宮頸病變中均檢測(cè)出HPV16或HPV18[1]。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號(hào)通路是G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在多項(xiàng)細(xì)胞生理過程中發(fā)揮作用[2]。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是cAMP的主要效應(yīng)分子，可以使多種細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)蛋白磷酸化[3]。有研究表明cAMP/PKA參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程，與VEGF的表達(dá)密切相關(guān)?，F(xiàn)為了探究cAMP/PKA通路在HPV16/18相關(guān)宮頸癌中的表達(dá)情況及臨床意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于我院2018年6月至2021年6月收治的86例宮頸癌患者作為研究組，取同期患有婦科其他良性病變行宮頸切除手術(shù)患者75例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2016年NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均行手術(shù)治療；③臨床資料完整；④自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行放化療或免疫治療；②嚴(yán)重肝腎功能不全；③嚴(yán)重自身免疫性疾病。研究組患者年齡33～65歲，平均年齡(46.23±12.62)歲。病理類型：鱗癌53例，腺癌33例。臨床分期：ⅠA期9例，ⅠB期15例，ⅡA期27例，ⅡB期18例，Ⅲ期17例。病理結(jié)果：高分化18例，中分化32例，低分化36例。對(duì)照組患者年齡34～68歲，平均年齡(47.22±11.38)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡等資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)及PKA檢測(cè)：將研究組患者術(shù)后切除的宮頸病變組織進(jìn)行收集，同時(shí)收集對(duì)照組患者術(shù)后切取的宮頸組織標(biāo)本于液氮中保存。將宮頸癌HeLa細(xì)胞(上海派通生物科技有限公司)置于含有10%胎牛血素和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞鋪于培養(yǎng)皿中，添加500 μmol/L的cAMP/PKA信號(hào)激動(dòng)劑db-cAMP，靜置2 h后檢測(cè)PKA活性。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)兩組研究對(duì)象組織標(biāo)本中的cAMP/PKA通路的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中陽性判定以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性，分為陰性、陽性。陰性：標(biāo)本未見陽性細(xì)胞；陽性：標(biāo)本可見陽性細(xì)胞。

對(duì)cAMP/PKA陽性組與陰性組標(biāo)本進(jìn)行HPV檢測(cè)，采用PCR擴(kuò)增及膜雜交法。根據(jù)醫(yī)用核酸分子快速雜交法試劑盒的用法，對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜及顯色結(jié)果。

對(duì)cAMP/PKA陽性組與陰性組進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)水平情況。

采用Spearman相關(guān)性分析，對(duì)cAMP/PKA通路表達(dá)與VEGF表達(dá)及宮頸癌HPV16/18感染情況進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“%”表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，采用Spearman相關(guān)分析cAMP/PKA通路表達(dá)與VEGF表達(dá)水平及宮頸癌HPV16/18感染情況的相關(guān)性，記P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中cAMP/PKA通路的表達(dá)水平比較

研究組cAMP/PKA的表達(dá)水平呈陰性表達(dá)有8例(9.30%)，陽性表達(dá)78例(90.70%)，cAMP/PKA通路陽性率為90.70%。對(duì)照組中其陰性表達(dá)為70例(93.33%)，陽性表達(dá)為5例(6.67%)。研究組標(biāo)本中cAMP/PKA通路陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 cAMP/PKA陽性組與陰性組中HPV16/18感染情況比較

78例cAMP/PKA陽性表達(dá)的宮頸病變組織中，感染HPV16 34例(43.59%)，感染HPV18 39例(50.00%)，HPV16/18總陽性率為93.59%。8例cAMP/PKA陰性表達(dá)的宮頸病變組織中，感染HPV16 2例(25.00%)，感染HPV18 2例(25.00%)，HPV16/18總陽性率為50.00%。cAMP/PKA通路陽性組中HPV16/18陽性率明顯高于陰性組(P<0.05)。見表1。

表1 cAMP/PKA陽性組與陰性組中HPV16/18感染陽性率比較(例，%)

2.3 cAMP/PKA陽性組與陰性組中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況

cAMP/PKA通路陽性組中，VEGF表達(dá)水平呈陰性表達(dá)8例(10.26%)，陽性表達(dá)70例(89.74%)；陽性率為89.74%；在陰性組中VEGF陰性表達(dá)5例(62.50%)，陽性表達(dá)3例(37.50%)，陽性率為37.50%。cAMP/PKA通路陽性組中VEGF陽性率明顯高于陰性組(P<0.05)。

2.4 Spearman相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，cAMP/PKA通路與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表達(dá)水平越高，VEGF的表達(dá)水平越高。cAMP/PKA通路與宮頸癌HPV16/18感染情況呈正相關(guān)性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表達(dá)水平越高，患者感染HPV16/18的概率越大。見表2。

表2 cAMP/PKA通路與VEGF表達(dá)及宮頸癌HPV16/18感染情況相關(guān)性分析

3 討論

宮頸癌以鱗癌為主要病理類型，且呈逐漸年輕化的趨勢(shì)，HPV感染是公認(rèn)的導(dǎo)致宮頸癌的主要因素[5]。HPV是一種DNA病毒，存在于人體各個(gè)部位，由于基因型的不同，HPV有100多種分型。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，HPV16、18、33等分型更易引起宮頸病變，高危型HPV16/18是目前臨床最為關(guān)注的分型[6]。近年來，臨床治療宮頸癌的主要方式有手術(shù)、放射及化學(xué)治療，但仍不能提高患者的生存率[7]。手術(shù)治療宮頸癌是主要的臨床手段，對(duì)病灶組織進(jìn)行切除，減慢病情發(fā)展，但宮頸癌早期發(fā)病時(shí)缺乏典型的臨床癥狀，因此大多患者在確診時(shí)已為中、晚期[8]。有研究表明，患者在治療宮頸癌的過程之中存在復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其發(fā)生的原因主要可能是腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，這是腫瘤發(fā)生及發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制[9]。在免疫系統(tǒng)中，cAMP/PKA信號(hào)通路主要在固有免疫和獲得性免疫相互調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮作用，通過結(jié)合不同的胞外和胞內(nèi)信號(hào)分子從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[10]。cAMP/PKA通路是經(jīng)典的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，由G蛋白偶聯(lián)受體作為介導(dǎo)[11]。當(dāng)外界信號(hào)分子對(duì)膜體進(jìn)行刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶被激活，從而細(xì)胞內(nèi)的cAMP表達(dá)水平上升，cAMP再激活PKA，PKA表達(dá)水平升高產(chǎn)生一系列的生物學(xué)反應(yīng)[12]。已有研究證實(shí)，cAMP/PKA在基因轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、細(xì)胞增殖、凋亡等過程中均有參與。PKA是cAMP的下游分子，其構(gòu)成是催化亞基和調(diào)節(jié)亞基，催化亞基可作為多種底物磷酸化的介導(dǎo)，調(diào)節(jié)亞基存在兩種亞型RⅠ和RⅡ，主要參與細(xì)胞增殖及分化的過程[13]。當(dāng)外界因素刺激細(xì)胞內(nèi)RⅠ型亞基高水平表達(dá)，引起細(xì)胞無限增殖，最后形成腫瘤[14]。當(dāng)cAMP/PKA信號(hào)通路被激活時(shí)，可調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的免疫逃逸，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展，導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)，患者發(fā)病致死率升高，因此深入研究宮頸癌的發(fā)展及及免疫逃逸機(jī)制可有效提高患者的生存率[15]。

腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移有兩種重要途徑，一是血管生成，二是上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，而VEGF是誘導(dǎo)血管生成的重要因子之一，參與腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移的過程[16]。目前已有研究表明VEGF與cAMP/PKA信號(hào)通路的激活也存在密切關(guān)系，激活cAMP/PKA信號(hào)通路，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成[17]。

在本研究中，通過檢測(cè)兩組研究對(duì)象cAMP/PKA通路的表達(dá)水平，可得研究組cAMP/PKA表達(dá)水平陰性表達(dá)為8例，對(duì)照組為70例；研究組陽性表達(dá)為78例，對(duì)照組為5例；研究組cAMP/PKA通路陽性率為90.70%，對(duì)照組為6.67%。研究組cAMP/PKA通路的陽性率明顯高于對(duì)照組，說明在宮頸癌組織細(xì)胞中，cAMP/PKA信號(hào)通路被激活，高于正常組織中的表達(dá)水平。對(duì)cAMP/PKA通路陽性組和陰性組的HPV16/18感染情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在cAMP/PKA通路陽性組中，感染HPV16為34例，陰性組為2例；陽性組中感染HPV18為39例，陰性組為2例。cAMP/PKA通路陽性組中HPV16/18總陽性率為93.59%，陰性組為50%，陽性組感染HPV16/18的幾率明顯大于陰性組。說明宮頸癌細(xì)胞中cAMP/PKA通路的表達(dá)水平升高，宮頸癌組織細(xì)胞的免疫逃逸被調(diào)控，患者機(jī)體免疫能力下降，所以感染HPV16/18的概率也增大。本研究還比較了cAMP/PKA通路陽性組與陰性組的VEGF表達(dá)水平，得到在陽性組中，VEGF陽性表達(dá)為70例，陰性組為3例；VEGF陰性表達(dá)陽性組為8例，陰性組為5例。由此可得，cAMP/PKA通路陽性表達(dá)可以促進(jìn)宮頸癌組織中VEGF的表達(dá)水平提高。經(jīng)過Spearman相關(guān)性分析，得到cAMP/PKA通路與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)，當(dāng)cAMP/PKA信號(hào)通路被激活時(shí)，宮頸癌組織中的VEGF表達(dá)水平也會(huì)升高；同時(shí)cAMP/PKA通路與宮頸癌HPV16/18感染也呈正相關(guān)，在宮頸癌組織中cAMP/PKA的表達(dá)水平越高，則患者感染HPV16/18的可能性越大。

綜上所述，宮頸癌組織中cAMP/PKA通路表達(dá)水平高于正常組織，cAMP/PKA通路的表達(dá)與VEGF表達(dá)水平及患者感染HPV16/18 呈正相關(guān)性，cAMP/PKA通路的表達(dá)水平升高，可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，同時(shí)患者感染HPV16/18的風(fēng)險(xiǎn)也升高。