四明山野生杜鵑花資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

李東賓 徐婧 何立平 許志斌 沈登鋒

（1.浙江省寧波市林場，浙江 寧波 315440；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040）

杜鵑花屬（Rhododendron）是北半球最大的木本植物屬，屬內(nèi)植物大多株形古樸優(yōu)雅、花色豐富艷麗，具有極高的觀賞價值，是我國十大傳統(tǒng)名花，在世界園藝界也占有重要地位[1]。中國是野生杜鵑花屬植物資源最豐富的國家，有720種，其中特有種450種[2]。浙江省杜鵑花資源有17種2變種及1變型（不包括栽培種）[3]，浙東四明山區(qū)域有自然分布的為映山紅（R.simsii）、滿山紅（R.mariesii）、華頂杜鵑（R.huadingense）、羊躑躅（R.molle）、馬銀花（R.ovatum）、云錦杜鵑（R.fortunei）6種，隸屬于4個亞屬[4]。

遺傳多樣性是生物多樣性的本質(zhì)，是物種適應(yīng)環(huán)境的核心基礎(chǔ)和進化的內(nèi)在動力，也是保護生物學(xué)研究重點工作，可為物種保護及利用提供適宜的策略[5]。隨著分子標記技術(shù)體系日益成熟，利用分子標記技術(shù)探究評估種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系已成為一種常用方法[6]。EST-SSR分子標記隨轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟開發(fā)經(jīng)濟、快速、簡單，具有信息量大、共顯性、通用性高等特點[7]，已被廣泛運用于龜峰山杜鵑花[8]、西雙版納苦茶[9]、邵武碎銅茶[10]、貴州刺梨[11]、額濟納濕地多枝檉柳[12]等種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系分析，并取得了良好的實驗結(jié)果。

四明山區(qū)域地處浙東寧波市西南 部，位 于121°0′31″～121°25′33″E，29°32′13″～29°59′56″N，光照充足，雨量充沛，屬于典型的北亞熱帶氣候[13]。區(qū)域內(nèi)地形復(fù)雜，山勢險峻，溝谷縱橫，植物資源豐富，是寧波最重要的生態(tài)保護區(qū)和水源涵養(yǎng)地。四明山區(qū)域分布著國內(nèi)最大規(guī)模的華頂杜鵑野生種群，華頂杜鵑為浙江省特有種，觀賞價值高，自然分布區(qū)域狹窄，種群數(shù)量稀少，并且在系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要價值[14]，已被列為浙江省珍稀瀕危植物、國家二級重點保護野生植物。華頂杜鵑1990年才被發(fā)現(xiàn)于天臺華頂山，因獨特的形態(tài)特征其分類歸屬尚存爭議，顏士輝[15]、李美芹[16]等做了華頂杜鵑的分子標記開發(fā)及親緣關(guān)系分析，均未能明確解決它的分類歸屬問題。本文利用EST-SSR標記進行四明山區(qū)域內(nèi)野生杜鵑花資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，從分子角度分析區(qū)域內(nèi)杜鵑花資源的種群遺傳多樣性和親緣關(guān)系以及華頂杜鵑的分類歸屬問題，旨在為該區(qū)域內(nèi)野生杜鵑花的資源保護、種群恢復(fù)、種質(zhì)創(chuàng)新提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對象為在四明山區(qū)域有自然分布的映山紅、滿山紅、華頂杜鵑、云錦杜鵑、馬銀花和羊躑躅6種野生杜鵑花資源。測試樣品于2021年9月在四明山國家森林公園內(nèi)海拔600～800m野生杜鵑花分布比較集中的區(qū)塊內(nèi)尋找目標野生杜鵑花資源并取樣，每個種采樣15個單株，單株距離要大于30m，每株采集3～5片健康幼嫩葉片，迅速置于盛有變色硅膠的密封袋干燥保存。采集完成后帶回實驗室用液氮處理后存于-70℃超低溫冰箱，用于DNA提取。

1.2 DNA提取與質(zhì)量檢測

采用改良CTAB法[17]提取試驗樣品總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行杜鵑花DNA分子量檢測，用紫外分光光度計（nano drop 2000）檢測提取的DNA的質(zhì)量和濃度，最終統(tǒng)一將不同樣品的DNA濃度稀釋至50ng/μL于-20℃放置備用。

1.3 EST-SSR引物的篩選

參照紅馬銀花的12對多態(tài)性好且穩(wěn)定的EST-SSR引物序列[18]進行本試驗引物的篩選，每種杜鵑花隨機選擇3個基因組DNA作為模板對12對引物進行篩選，選取條帶擴增清楚，多態(tài)性高的引物用來進行試驗材料的群體遺傳多樣性分析。引物由上海生物工程公司合成，篩選出的引物在正引物的5'末端進行熒光標記。PCR體系20μL：10μL 2×Taq plus PCR MasterMix ，1μL 50μg/mL模板DNA、0.3μL 10uM 的正向引物和反向引物、和去離子水補足至20μL。PCR 擴增程序如下：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，53～58℃退火30s，72℃延伸45s，運行32個循環(huán)；72℃最終延伸7min，最后4℃保存終止反應(yīng)。利用毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行分析，使用genemarker 2.0進行結(jié)果的確認和讀取。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

使用GenAlex 6.41估算6個種群的遺傳參數(shù)，包括位點比較等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、shannon多樣性指數(shù)（I）、群體內(nèi)固定系數(shù)（F）等來衡量6個杜鵑種群內(nèi)遺傳多樣性的水平。并計算種群間遺傳分化系數(shù)（Fst）、基因流（Nm）、Nei’s標準遺傳距離、親緣關(guān)系及主成分分析(PCoA)和分子方差分析（AMOVA）等，并根據(jù) Nei’s標準遺傳距離，利用 NTSYSpc 2.10e軟件非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)對各居群進行聚類來分析種群間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

使用6個不同種的杜鵑花基因組DNA進行了12對EST-SSR引物組合篩選，共篩選出6對電泳條帶清楚，多態(tài)性高的引物組合用于試驗樣品的遺傳分析。

表1 篩選出的6對EST-SSR引物的序列信息

2.2 6種杜鵑花資源的遺傳多樣性分析

根據(jù)GenAlex分析結(jié)果（表2）可知，四明山6種野生杜鵑花的遺傳多樣性參數(shù)差異明顯。等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）為1.75～5.50、1.33～2.87，均表現(xiàn)為馬銀花最大，華頂杜鵑最小。馬銀花和華頂杜鵑的觀測雜合度（Ho）＞期望雜合度（He），其余4種則Ho＜He。Shannon’s多樣性指數(shù)（I）比較得出，馬銀花和羊躑躅的遺傳多樣性顯著高于華頂杜鵑，排序為馬銀花＞羊躑躅＞映山紅＞云錦杜鵑＞滿山紅＞華頂杜鵑。比較F固定指數(shù)可知，映山紅0.621最高，滿山紅和云錦杜鵑接近于0，而華頂杜鵑最低為-0.385。

表2 6個杜鵑花屬種群遺傳多樣性指數(shù)

由表3可知，四明山野花杜鵑生資源種群間遺傳分化系數(shù)Fst為0.125～0.420，平均值0.274，馬銀花與華頂杜鵑種群間的遺傳分化最大，與羊躑躅種群間的遺傳分化最??；種群間基因流(Nm)為 0.345～1.743，平均值0.786，馬銀花與羊躑躅種群間的基因流最大，與華頂杜鵑種群間的基因流最小。野生杜鵑種群的分子方差(AMOVA)分析顯示(表4)，31%的遺傳變異存在于種群間，69%的遺傳變異存在于種群內(nèi)。

表3 6個杜鵑花屬種群成對分化系數(shù)及基因流分析

表4 6個杜鵑花屬種群分子方差（AMOVA）分析

2.3 6種杜鵑花資源的親緣關(guān)系分析

由表5可知，6種杜鵑花親緣關(guān)系為0.114～0.816，遺傳距離為0.203～2.173。其中馬銀花和滿山紅遺傳距離最大為2.220，親緣關(guān)系最遠為0.109；滿山紅與華頂杜鵑遺傳距離最小為0.252，親緣關(guān)系最近為0.778。利用 Nei's遺傳距離，采用平均聚類法對6種杜鵑花自然種群進行聚類分析（圖1），6種野生杜鵑花資源明顯聚為2組4類，映山紅、滿山紅和華頂杜鵑聚為1類，其他3種單獨為1類。利用 GenAlEx 分析種群間主成分分析(圖2)，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻率分別為 66.26%和20.64%，累計貢獻率86.90%。圖中2個種的距離越近，說明其遺傳背景差異越小，親緣關(guān)系越近。結(jié)果表明，映山紅、滿山紅和華頂杜鵑明顯聚在一起，與其他3種彼此距離較遠，此結(jié)果和基于Nei's 遺傳距離得出的聚類結(jié)果一致。

表5 6個杜鵑屬種群遺傳距離和親緣關(guān)系

圖1 6個杜鵑花的聚類分析圖

圖2 6個杜鵑花種群的PCA分析

3 討 論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是衡量一個物種環(huán)境適應(yīng)力和進化潛力的重要指標，是物種生存和進化的內(nèi)在基礎(chǔ)，遺傳多樣性越高，適應(yīng)性越強和進化潛力越大[12]。本研究選用了同屬植物紅馬銀花的12對EST-SSR引物篩選出了6對擴增效果好、多態(tài)性高的引物進行了四明山區(qū)域內(nèi)6種杜鵑花屬植物的遺傳多樣性分析，表明杜鵑花屬植物的遺傳背景具有很高的相似性，引物的通用性較好，所用的EST-SSR引物可推廣應(yīng)用于更多杜鵑花屬植物。結(jié)果顯示四明山區(qū)域內(nèi)的馬銀花 (He=0.583，I=1.216)、羊躑躅（He=0.558，I=1.048）、云錦杜鵑(He=0.456，I=0.822)跟同屬的其他杜鵑相比擁有很高的遺傳多樣性，這和相關(guān)杜鵑花遺傳多樣性研究結(jié)論基本一致[16,18,19]。調(diào)查區(qū)域內(nèi)羊躑躅種群的數(shù)量極少，但其遺傳多樣性卻不低，推測造成這種現(xiàn)象的原因是區(qū)域內(nèi)近期花木種植造成的羊躑躅適生環(huán)境破壞和因其獨特的藥用價值帶來的大肆采挖導(dǎo)致的居群數(shù)量驟減，這和紅馬銀花[18]、白桫欏[20]、櫨菊木[21]的致瀕因素一致。華頂杜鵑He、I兩個遺傳多樣性參數(shù)均為6種杜鵑花資源中最低（He=0.190，I=0.298），表明華頂杜鵑在四明山野生杜鵑花種群中遺傳多樣性水平最低。再加上其生境島狀狹域分布、野外數(shù)量很少、種群結(jié)構(gòu)多為衰退型[22]，屬于典型的極小種群瀕危植物，如果不及時加以保護，其潛在的基因資源就會隨植株的消亡而消失。依據(jù)Nagylaki[23]的理論，固定指數(shù)（F）大于0的映山紅和羊躑躅存在較高的近交現(xiàn)象，云錦杜鵑和滿山紅固定指數(shù)接近0以自由交配為主，馬銀花和華頂杜鵑固定指數(shù)小于0，主要以異交為主。

遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)可以用來描述種群間的分化程度，種群間分化系數(shù)越大，基因流越小，則種群間差異就越大。四明山野生杜鵑種群間的Fst均值為0.274，大于貴州百里杜鵑（Fst=0.133）[24]和大別山地區(qū)杜鵑（Fst=0.175）[25]種群間的遺傳分化系數(shù)，并且超過0.25，說明四明山區(qū)域內(nèi)杜鵑花資源已存在很大的遺傳分化?；蛄鳎∟m）大于1時，種群間的基因交流比較廣泛，能夠抵制種群間由遺傳漂變引起的遺傳分化，而基因流小于1，則種群間基因交流受阻，遺傳分化加重[26]。四明山野生杜鵑花種群間基因流均值0.786，表明種群間基因交流受阻。本研究中華頂杜鵑與馬銀花的遺傳分化系數(shù)最大、基因流最小，表明該區(qū)域內(nèi)兩種杜鵑花的差異最大。6種杜鵑自然種群的分子方差(AMOVA)分析顯示，31%的遺傳變異存在于種群間，69%的遺傳變異存在于種群內(nèi)。表明種群間已出現(xiàn)明顯分化，該結(jié)果與種群間遺傳分化系數(shù)得出的結(jié)論相一致。

3.2 親緣關(guān)系分析

四明山6種野生杜鵑花資源隸屬于4種杜鵑花亞屬，其中云錦杜鵑屬于常綠杜鵑亞屬（Subgen.Hymenanthes(Blume)K.Koch），馬銀花屬于馬銀花亞屬（Subgen.AzaleastrumPlanch.ex K.Koch），羊躑躅屬于羊躑躅亞屬（Subgen.Pentanthera(G.Don) Pojarkova），映山紅和滿山紅屬于映山紅亞屬（Subgen.Tsutsusi(G.Don)Pojarkova）。本研究聚類結(jié)果和PCA分析結(jié)果一致，均表現(xiàn)為映山紅和滿山紅具有很近的親緣關(guān)系，符合經(jīng)典系統(tǒng)分類；結(jié)果還顯示馬銀花和羊躑躅也有較近的親緣關(guān)系，這和李美芹[16]、張哲瑋[27]、黃承玲[28]的聚類結(jié)果基本一致；以上都表明了本研究得出的親緣關(guān)系具有較好的準確性。華頂杜鵑為丁炳揚1990年才發(fā)現(xiàn)的新種[29]，根據(jù)其落葉習(xí)性、小枝具柔毛和葉3～5枚假輪生狀密集枝頂，將其歸入映山紅亞屬輪葉杜鵑組，但其種子形態(tài)具有許多獨特之處，與其余種類均明顯不同[30]。后來章月皎以花芽、葉芽、花粉以及種子形態(tài)特征為依據(jù)認為華頂杜鵑應(yīng)該屬于羊躑躅亞屬的成員[14]。顏士輝等做了華頂杜鵑ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及親緣關(guān)系的初步分析，結(jié)果對華頂杜鵑的分類地位沒有得到明確結(jié)論[15]。李美芹等以寧波地區(qū)的杜鵑花種質(zhì)資源為研究材料開發(fā)EST-SSR引物并探究遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，聚類結(jié)果顯示華頂杜鵑和云錦杜鵑聚為一類[16]，但華頂杜鵑和云錦杜鵑植株形態(tài)和特性均差異很大，很難劃歸于同一類群。本研究通過篩選的ESTSSR引物對華頂杜鵑的遺傳多樣性和親緣關(guān)系做了分析，結(jié)果顯示華頂杜鵑與滿山紅親緣關(guān)系最近，與羊躑躅和馬銀花親緣關(guān)系較遠，本結(jié)論與丁炳揚最初根據(jù)其形態(tài)特征作出的分類歸屬一致，佐證了華頂杜鵑隸屬于映山紅亞屬輪生葉杜鵑組的結(jié)論。但結(jié)論仍然受到樣本量的代表性和ESTSSR分子標記的引物以及方法局限性的限制，后續(xù)可利用其他分子標記或者基因測序等方法進一步驗證。

優(yōu)先保護瀕危植物有助于延緩物種多樣性的流失、維護生態(tài)平衡以及促進生態(tài)可持續(xù)發(fā)展，對我國生物多樣性保護具有重要意義[31]。羊躑躅具有很高的藥用價值，花、果實和根等均可供藥用，可祛風(fēng)除濕、舒筋活血、鎮(zhèn)痛止痛。雖然試驗結(jié)果顯示其仍具有較高的遺傳多樣性水平，但因人為掠奪式挖掘，導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)植株急劇減少，建議采取搶救式種質(zhì)資源異地保存，輔以種苗擴繁的資源保護措施。華頂杜鵑具有眾多特異的植物學(xué)性狀，在杜鵑花屬植物的進化和系統(tǒng)發(fā)育中具有重要的研究價值，其種群數(shù)量極少、遺傳多樣性水平低，屬于典型的極小種群瀕危植物。建議在就地保護和遷地保育的基礎(chǔ)上，開展人工多種源種苗繁育并嘗試野外回歸工作，增加野外種群的植株數(shù)量、優(yōu)化種群的年齡結(jié)構(gòu)、豐富種群的遺傳多樣性，緩解其瀕危程度。