設施根結線蟲發(fā)病與未病土壤真菌多樣性比較

秦立金，劉銘，李艷麗，劉凱炎，陳凡凡，祝海穎，陸鳴，龐文敏，張志潔，劉海婷

（1.赤峰學院 農學院；2.赤峰市農牧業(yè)綜合檢驗檢測中心；3.赤峰學院 化學與生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

1 引言

番茄屬于茄科番茄屬，又名西紅柿、番柿、洋柿子等，在國外有“金蘋果”“愛情果”等美譽[1]。由于管理等問題，導致番茄根結線蟲病害日益嚴重。根結線蟲（Meloidogyne spp.）是一種在全世界發(fā)生和分布的植物內寄生線蟲，寄主種類達到3000多種，嚴重威脅著世界農業(yè)的安全生產[2]在我國，根結線蟲發(fā)生范圍廣，發(fā)病率高，防治困難，已成為嚴重阻礙我國農業(yè)生產的一大病害，每年因根結線蟲造成經濟損失巨大[3]。根結線蟲病是危害番茄的主要土傳病害之一，并且根結線蟲的入侵會使植物根系形成根結，其他病害更容易侵染，嚴重影響番茄的品質。土壤中存在各種各樣的微生物群體，它們對土壤有機質分解、養(yǎng)分循環(huán)、土壤結構、植物生長發(fā)育以及整個生態(tài)平衡都具有重要作用[4]。真菌是有機物質分解和土壤生物量的主要組成部分,在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用[5]。

有關土壤真菌多樣性的研究已見報到，李天來[6]發(fā)現番茄連作后改變了土壤真菌種群平衡，這可能是導致番茄產生連作障礙的重要原因之一。王澎[7]等人發(fā)現施用有機氮(Gly)肥在一定程度上可以提高真菌的多樣性，提高抗病原菌數量。以上研究在一定程度上都表明了發(fā)病與真菌多樣性有關。

本試驗擬測定設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤的真菌多樣性指標，分析其在界、門、綱、目、科、屬水平的多樣性變化，找出發(fā)病與未發(fā)病土壤的真菌多樣性差異，為以后根結線蟲病的有效防控提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

設施番茄發(fā)病、未發(fā)病棚室土壤采自內蒙古赤峰市翁牛特旗楊營子設施番茄棚室。

2.2 實驗設計

上茬番茄拉秧時，對設施番茄發(fā)病與未發(fā)病棚室進行土壤取樣，每個棚室采集土壤3份；采樣時間為上茬番茄拉秧時，同時，調查根結線蟲發(fā)病率及病情指數；采集回的土樣及時處理，過1mm篩，標記，-80攝氏度冰箱冷凍，待送檢；對測得的ITS真菌多樣性數據進行顯著性檢驗和分析。

2.3 ITS測序實驗流程

將田間采集的土壤樣品利用OMEGA的試劑盒提取土壤DNA。對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測，查看基因組DNA的完整度與濃度。利用Qubit2.0DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。ITS測序使用的文庫構建步驟遵循Illumina測序儀文庫構建方法。從基因組DNA樣品開始，整個ITS測序具體步驟如下：本次測序以ITS2為目標區(qū)域進行引物設計，引物序列為fITS7GTGARTCATCGAATCTTTG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。使用DNA模板50ng，25uL的PCR體系，使用Phusion酶擴增25～35個循環(huán)。一輪PCR擴增反應之后，在正反向引物兩端分別加上不同的barcodes，再進行下一輪擴增。擴增完成的PCR產物使用beads純化之后進行上機測序。PCR產物用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer做歸一化處理。構建好的文庫上樣到cBot或簇生成系統(tǒng)，利用Illumina MiSeq測序儀進行2x300bp paired-end測序。對于MiSeq測序獲得的雙端數據，首先根據barcode信息進行樣品區(qū)分，然后根據overlap關系進行merge拼接成tag，接著對拼接完成的數據進行數據過濾，隨后進行Q20、Q30等質控分析。對最終獲得clean數據進行OTU聚類分析和物種分類學分析。

2.4 實驗數據

采用IBM SPSS26.0對數據進行平均數±標準差計算和成對數據t檢驗。

3 結果和分析

3.1 界水平差異

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平絕對和相對豐度差異比較見表1和表2，發(fā)病土壤的Fungi/真菌界與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2未達到差異顯著（P＞0.05），未發(fā)病老棚/CK1分別比發(fā)病/Ne和未發(fā)病新棚/CK2提高了9.62%和25.00%。

表1 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平絕對豐度差異比較

表2 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平相對對豐度差異比較

3.2 門水平差異比較

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平絕對和相對豐度差異比較見表3和表4，發(fā)病土壤的/NeAscomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2未達到差異顯著(P＞0.05)，Ascomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌在未發(fā)病老棚/CK1相對豐度分別可達78.24%和3.56%（見表4），而在未發(fā)病新棚/CK2相對豐度分別為94.94%和3.35%。發(fā)病土壤/Ne的Basidiomycota/擔子菌門與未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2未達到差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2達到差異顯著(P＜0.05)，相對豐度為18.19%和2.16%，未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.69倍。

表3 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平絕對含量差異比較

表4 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平相對含量差異

3.3 綱水平差異比較

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平絕對和相對豐度差異比較見表5和表6，發(fā)病土 壤/Ne的Leotiomycetes/錘 舌 菌 綱 和Agaricomycetes/傘菌綱與未發(fā)病老棚土壤/CK1和未發(fā)病新棚土壤/CK2未達到0.05差異顯著（p＞0.05），但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2差異顯著（p＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1分別是未發(fā)病新棚土壤/CK2的5.32倍和10.04倍（見表5），其中，Leotiomycetes/錘舌菌綱和Agaricomycetes/傘菌綱在未發(fā)病老棚土壤/CK1相對豐度可達35.57%和18.05%，而在未發(fā)病新棚土壤/CK2的相對豐度分別為8.40%和2.06%（見表6）；發(fā)病土壤的Dothideomycetes/座囊菌綱與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達到差異顯著（p＞0.05），但與未發(fā)病新棚土壤/CK2差異顯著，（p＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的17.84倍（見表5），其中，在發(fā)病土壤/Ne和未發(fā)病新棚土壤/CK2的相對豐度分別為3.62%和3.35%（見表6）；發(fā)病土壤的Lecanoromycetes/茶漬綱、Sord ariomycetes/子囊菌綱和Unspecified_Fungi（未指明）與未發(fā)病土壤未達到差異顯著（p＞0.05）（見表5），其中，Unspecified_Fungi/未指明絕對和相對豐度占據較大比例，在3種土壤中，相對豐度分別可達74.09%、44.22%和89.41%。

表5 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平絕對豐度差異比較

表6 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平相對豐度差異比較

3.4 目水平差異比較

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平絕對和相對豐度差異見表7和表8，發(fā)病土壤/Ne的Agaricales/傘 菌 目、Cantharellales/雞 油 菌 目、Helotiales/柔 膜 菌 目、Rhytismatales/斑 痣 盤 菌 目、Hypocreales/肉 座 菌 目、Ostropales/厚 頂 盤 目、Hymenochaetales/銹革孔菌目、Sebacinales/蠟殼耳目和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2均未達到差異顯著(P＞0.05)。發(fā)病土壤Pleosporales/腔菌目與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達到差異顯著(P＞0.05)，但與未發(fā)病新棚土壤/CK2達到差異顯著（P＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的17.84倍，相對豐度分別為1.84%和0.12%。

表7 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平絕對豐度差異比較

表8 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平相對豐度差異比較

3.5 科水平差異比較

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平絕對和相對豐度差異比較見表9和表10，發(fā)病土壤/Ne的Marasmiaceae/小皮傘科、Ceratobasidiaceae/角 擔 菌 科、Agaricaceae/傘 菌 科、Rhytismataceae/斑 痣 盤 菌 科、Hypocreaceae/肉 座 菌 科、Stictidaceae/肉 星 裂 菌 科、Helotiaceae/柔 膜 菌 科、Hymenochaetaceae/刺革菌科、Sebacinaceae/蠟殼耳科、Pleosporaceae/孢 菌 科、Amanitaceae/鵝 膏 科 和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)。發(fā)病土壤/Ne的Psathyrellaceae/水蕨科與未發(fā)病新棚土壤/CK2達到差異顯著（P＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對豐度分別為1.12%和0.02%。發(fā)病土壤/Ne的Inocybaceae/絲蓋傘科與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚/CK2的4.81倍，在未發(fā)病老棚/CK1與未發(fā)病新棚/CK2的相對豐度分別可達0.04%和0.01%。

表9 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平絕對豐度差異比較

表10 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平相對豐度差異比較

3.6 屬水平差異比較

設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平絕對和相對豐度差異見表11和表12，發(fā)病土壤/Ne的Agaricus/傘 草 屬、Lophodermium/散 斑 殼屬、Trichoderma/木 霉 屬、Hymenochaete/刺 革 菌 屬、Sebacina/蠟殼菌屬和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1和未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)。未發(fā)病土壤/Ne的Coprinellus/鬼傘屬與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，與未發(fā)病新棚土壤/CK2達到顯著差異(P＜0.05)，是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對豐度分別為0.12%和0.02%。發(fā)病土壤/Ne的Inocybe/絲蓋傘屬與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚/CK2的4.81倍，在未發(fā)病老棚/CK1與未發(fā)病新棚/CK2的相對豐度分別可達0.03%和0.01%。

表11 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平絕對豐度差異比較

表12 根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平相對豐度差異比較

4 討論與結論

根結線蟲(Meloidogyne spp.)是一種高度?；偷闹参锊≡€蟲，主要危害植物的根部，造成植株產量降低，甚至死亡。南方根結線蟲(M.incognita)寄主范圍廣，在國內分布最廣，危害最大，可加重土傳性真菌危害和大部分細菌病害的發(fā)生，嚴重威脅全世界西甜瓜、蔬菜、糧食作物等作物的生長[10-14]，使我國各種作物年平均產量損失達10-15%[15]。

張仁軍[8]等人分析了煙田根際根結線蟲病土與周邊健康土壤微生物群落，通過對比分析發(fā)現健康煙田與根結線蟲發(fā)病煙田根際土壤真菌微生物群落在門和屬水平上組成相似，但物種豐度存在差異，其中，擔子菌門(Basidiomycota)在健康煙田中占優(yōu)勢，子囊菌門(Ascomycoda)。在發(fā)病煙田中占優(yōu)勢。本實驗結果表明，Ascomycota/子囊菌門在根結線蟲發(fā)病與健康土壤中差異不顯著，本研究結果與前人[8]研究結果存在不一樣的地方，分析原因可能是因為取土地點和發(fā)病作物不同導致的，本實驗取土的地點為內蒙古赤峰市設施番茄棚室土樣，而張仁軍等人取土土樣為云南省煙草根際土壤。

本研究結果表明，發(fā)病土壤的Basidiomycota/擔子菌門與未發(fā)病老棚和未發(fā)病新棚未達到差異顯著，但未發(fā)病老棚和未發(fā)病新棚達到差異顯著，且未發(fā)病老棚是未發(fā)病新棚的9.69倍，Basidiomycota/擔子菌門為未發(fā)病土壤的優(yōu)勢菌群，此結果與前人[8]一致。陳波[9]等人對香蕉枯萎病區(qū)土壤真菌多樣性進行了分析，發(fā)病同一地區(qū)蕉園中的發(fā)病蕉園土壤真菌群落多樣性比健康土壤豐富，但未進行界、門、綱、目、科、屬水平的具體分析。

本研究結果表明，設施番茄根結線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤，未發(fā)病老棚和新棚土壤的真菌群落多樣性不同，未發(fā)病老棚Ascomycota/子囊菌門、Leo-tiomycetes/錘舌菌綱、Agaricomycetes/傘菌綱、Inocybaceae/絲蓋傘科、Inocybe/絲蓋傘屬顯著高于未發(fā)病新棚，發(fā)病土壤與未發(fā)病老棚的Pleosporales/腔菌目顯著高于未發(fā)病新棚，發(fā)病土壤Psathyrellaceae/水蕨科、Coprinellus/鬼傘屬顯著高于未發(fā)病新棚。綜上所述，內蒙古赤峰地區(qū)設施番茄根結線蟲發(fā)病土壤和未發(fā)病老棚土壤的真菌多樣性高于未發(fā)病新棚土壤。