抗體原液凍融過程中穩(wěn)定性探究及凍融工藝建立

劉向東，錢軍華，王威

自 1986年全球首個(gè)單抗藥物批準(zhǔn)上市以來，經(jīng)過30 多年的發(fā)展，單抗目前已成為全球生物制藥增長最快的細(xì)分領(lǐng)域。近年來我國的抗體藥物也有了迅速的發(fā)展，截至2021年 11月，已批準(zhǔn)上市的國產(chǎn)單抗藥物數(shù)量達(dá) 31 個(gè)[1]。生產(chǎn)中單抗藥物主要通過基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞），經(jīng) CHO 細(xì)胞生長培養(yǎng)表達(dá)所需蛋白并純化獲得抗體原液，最后制劑灌裝得到單抗成品。為了更好地保護(hù)蛋白的穩(wěn)定，保證原液的質(zhì)量，延長有效期，抗體原液一般都選擇低溫冷凍保存，灌裝時(shí)重新解凍后使用。有研究顯示抗體原液在凍融過程中，在-5 ～ 0 ℃ 時(shí)發(fā)生相變（固液兩態(tài)轉(zhuǎn)化），形成冰晶體，內(nèi)部溶質(zhì)產(chǎn)生冷凍濃縮，酸堿度失衡，局部 pH 值及離子強(qiáng)度發(fā)生變化，蛋白發(fā)生聚集[2-4]?？贵w的聚集大多都是不可逆的，有學(xué)者提出了抗體聚集物有可能通過兩種途徑使正在接受抗體類藥物治療的患者產(chǎn)生免疫原性：T 細(xì)胞依賴途徑以及細(xì)胞因子激活途徑，而且分子量越大的聚集物其免疫原性越強(qiáng)，最終，免疫原性反應(yīng)不僅大幅降低了藥物體內(nèi)的療效，而且易引發(fā) I 型超敏反應(yīng)[2]。因此有必要針對(duì)抗體原液凍融過程穩(wěn)定性及影響因素進(jìn)行研究，以及建立穩(wěn)定的原液凍融工藝，指導(dǎo)生產(chǎn)。

以公司在研的單抗產(chǎn)品為例，參照《中華人民共和國藥典》2020年版（ChP 2020）四部中“生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，通過縮小模型實(shí)驗(yàn)探究固有因素和可變因素在凍融過程中對(duì)原液蛋白穩(wěn)定性的影響。固有因素包括分子類型和蛋白濃度；可變因素包括原液的包裝形式、包裝規(guī)格和凍融條件。因?qū)δ繕?biāo)函數(shù)（蛋白質(zhì)量）沒有充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和預(yù)判，所以選擇單因素“優(yōu)選法”（即斐波那契法）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素包含不同的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過不同的策略組合，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理分別以橫向與對(duì)照品（未經(jīng)凍融的樣品）進(jìn)行比較，縱向與不同分子類型、蛋白濃度、包裝形式、包裝規(guī)格以及凍融條件進(jìn)行比較，以探討抗體原液凍融過程穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 選用 5 種抗體原液，分別為原液 1（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG1 野生型）、原液 2（蛋白濃度：10 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 3（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 4（蛋白濃度：150 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 5（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG4 突變型），均為本公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器和設(shè)備 -60 ℃ U410-86 型超低溫冰箱為德國Premium 公司產(chǎn)品；34970A 型多路溫度記錄儀購自安捷倫公司；所用材料：凍存瓶（規(guī)格：125 ml、500 ml 和1000 ml，材質(zhì)：聚碳酸酯）購自美國 Nalgene 公司；凍融袋（規(guī)格：125 ml、500 ml 和 1000 ml，材質(zhì)：多層復(fù)合膜）購自美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定性研究方法

1.2.1.1 樣品冷凍 按照表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)容器分裝80% 標(biāo)識(shí)體積的原液，插入溫度記錄探頭，使其垂直懸空在溶液中心位置，將所有樣品一起放入 -60 ℃ 冰箱，開啟多路溫度記錄儀記錄溫度曲線。待所有樣品溫度都降至-60 ℃ 以下，保持 4 h 以上，使產(chǎn)品徹底凍結(jié)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.2 樣品解凍 解凍時(shí)分別置于不同實(shí)驗(yàn)條件下靜止解凍，至所有冰晶體全部融解，解凍結(jié)束。

1.2.1.3 反復(fù)凍融 選取樣品 1（IgG1 野生型）、樣品 4（IgG1 突變型）和樣品 7（IgG4 突變型）3 種不同分子類型樣品按照實(shí)驗(yàn) 1、4 和 7 條件反復(fù)凍融 3 次，考察反復(fù)凍融對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響。

1.2.1.4 樣品檢測(cè) 樣品解凍后取樣按照 ChP 2020三/四部中相關(guān)測(cè)定方法進(jìn)行 pH、蛋白含量、不溶性微粒、分子排阻-高效液相色譜（size exclusion chromatography-high perfermance liquid chromatography，SEC-HPLC）、離子交換-高效液相色譜（cation exchanged-high perfermance liquid chromatography，CEX-HPLC）、毛細(xì)管電泳/非還原法（non-reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，NrCE-SDS）、毛細(xì)管電泳/還原法（reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，rCE-SDS）、結(jié)合活性和細(xì)胞生物學(xué)活性（或競(jìng)爭(zhēng)活性）檢測(cè)。

1.2.2 凍融工藝建立方法

采用“4 + 2”的模式建立抗體原液凍融工藝，如圖1所示?！?”是指 4 步操作：①設(shè)計(jì)不同凍融條件，通過縮小模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；②確定蛋白質(zhì)量穩(wěn)定的最長相變時(shí)間；③選擇放大后包裝材料及凍融條件；④結(jié)合凍融條件確定凍融參數(shù)，建立凍融工藝?！?”是 2 個(gè)原則：①是保持相變時(shí)間不變的原則進(jìn)行工藝放大；②盡量避免反復(fù)凍融。

圖1 抗體原液凍融工藝建立

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.1.1 相變時(shí)間

相變時(shí)間是抗體原液凍融過程中，固-液兩種形態(tài)轉(zhuǎn)化時(shí)所持續(xù)的時(shí)間，一般在 -5 ～ 0 ℃ 之間，在凍融曲線中近似為一條直線。根據(jù)溫度記錄曲線，不同實(shí)驗(yàn)條件下原液在凍融過程中相變時(shí)間如表2。

表2 相變時(shí)間（min）

2.1.2 樣品檢測(cè) 每個(gè)實(shí)驗(yàn)編號(hào)對(duì)應(yīng)樣品號(hào)（例，實(shí)驗(yàn)編號(hào) 1 對(duì)應(yīng)樣品 1），樣品檢測(cè)結(jié)果如表3。

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 固有因素和可變因素對(duì)凍融穩(wěn)定性的影響

2.1.3.1 固有因素凍融穩(wěn)定性結(jié)果（圖2） 結(jié)果顯示：①與對(duì)照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突變型和 IgG4 突變型三種不同分子類型的原液凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結(jié)合活性及生物學(xué)活性（或競(jìng)爭(zhēng)活性）均未發(fā)生明顯變化，三種分子類型的原液不溶性微粒均稍有增加；IgG1 野生型和IgG1 突變型 SEC-HPLC 聚體含量未有明顯變化，而 IgG4突變型 SEC-HPLC 聚體含量增加 85.7%；②與對(duì)照品相比，IgG1 突變型抗體不同蛋白濃度（10 mg/ml、50 mg/ml和 150 mg/ml）原液凍融后樣品 pH、蛋白含量、SEC-HPLC聚體含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS純度、結(jié)合活性及生物學(xué)活性與對(duì)照品相比均未發(fā)生明顯變化，3 種蛋白濃度的原液凍融后不溶性微粒均稍有增加。

2.1.3.2 可變因素凍融穩(wěn)定性結(jié)果 固有因素中通過對(duì)不同分子類型和不同蛋白濃度的原液凍融穩(wěn)定性分析，IgG4突變型分子凍融過程中存在不穩(wěn)定現(xiàn)象。因此在可變因素中選擇以 IgG4 突變型原液就不同包裝形式、包裝規(guī)格和凍融條件進(jìn)行穩(wěn)定性研究。結(jié)果（圖2）顯示：①與對(duì)照品相比，IgG4 突變型抗體原液在凍存瓶和凍融袋兩種包裝形式中凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS純度、rCE-SDS 純度、結(jié)合活性及競(jìng)爭(zhēng)活性均未發(fā)生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加；SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，且同等規(guī)格下凍存瓶聚體含量增加更為明顯，125 ml和 500 ml 規(guī)格結(jié)論一致，凍存瓶中聚體含量分別較凍融袋增加 62.5% 和 33.3%，較對(duì)照品增加 85.7% 和 185.7%；②與對(duì)照品相比，IgG4 突變型抗體原液在凍存瓶中由 125 ml放大至 500 ml，凍融袋中由 125 ml 放大至 500 ml 和1000 ml，凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結(jié)合活性及競(jìng)爭(zhēng)活性均未發(fā)生明顯變化，不溶性微粒稍有增加；SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，且隨著包裝規(guī)格的增大，聚體含量增加越多，凍存瓶規(guī)格增大 4 倍時(shí)，聚體含量增加 53.8%，凍融袋規(guī)格增大 4 倍時(shí)，聚體含量增加 87.5%，凍融袋規(guī)格增大8 倍時(shí)，聚體含量增加 175%；③與對(duì)照品相比，IgG4 突變型抗體原液在冷凍條件（-60 ℃ 冰箱和 -60 ℃ 冰箱 +泡沫箱）和解凍條件（25 ℃ 室溫、25 ℃ 水浴、8 ℃ 環(huán)境和冰水浴）凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結(jié)合活性及競(jìng)爭(zhēng)活性均未發(fā)生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加；不同冷凍條件對(duì) SEC-HPLC 聚體含量增加影響較小，不同解凍條件對(duì)聚體含量增加影響明顯，8 ℃ 環(huán)境解凍時(shí)聚體含量增加400%。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)條件下 SEC-HPLC 聚體檢測(cè)結(jié)果（樣品 5 ～ 13 橫向?qū)φ站鶠閷?duì)照 5）

2.1.4 反復(fù)凍融對(duì)穩(wěn)定性的影響 結(jié)果（圖3）顯示：①與對(duì)照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突變型和 IgG4 突變型三種不同分子類型的原液反復(fù)凍融三次后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS純度、結(jié)合活性及生物學(xué)活性（或競(jìng)爭(zhēng)活性）均未發(fā)生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加，且與凍融次數(shù)成正比例增加；② IgG1 野生型和 IgG1 突變型 3 次反復(fù)凍融后，SEC-HPLC 聚體含量未有明顯變化，IgG4 突變型反復(fù)凍融后，聚體含量增加明顯，且與凍融次數(shù)成正比例增加。

圖3 反復(fù)凍融后不溶性微粒和 SEC-HPLC 聚體檢測(cè)結(jié)果

2.2 凍融工藝建立

以本公司在研的某 IgG1 突變型抗體原液為例簡(jiǎn)單介紹凍融工藝建立的過程，為讀者提供參考。通過縮小模型選用 125 ml 凍存瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，凍融曲線如圖4 所示。

圖4 IgG1 突變型抗體原液凍融曲線（溫度探頭 CH.101 ～ CH.104 分別檢測(cè)樣品 C、樣品 B、樣品 D 和樣品 A 的溫度，CH.105 ～ CH.109 檢測(cè)環(huán)境溫度）

由凍融曲線可知，樣品 A ～ 樣品 D 的相變時(shí)間分別為 70 min、145 min、220 min 和 480 min。

樣品解凍后取樣按照 1.2.1.4 檢測(cè)方法進(jìn)行蛋白含量、不溶性微粒、SEC-HPLC 聚體、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、結(jié)合活性和生物學(xué)活性檢測(cè)來分析不同相變時(shí)間對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響，解凍后樣品檢測(cè)結(jié)果如表4。

表4 縮小模型原液凍融檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照品相比，該抗體原液經(jīng)最長相變時(shí)間 480 min凍融后，其蛋白含量、SEC-HPLC 聚體、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、結(jié)合活性和生物學(xué)活性均未發(fā)生明顯變化，不溶性微粒有增加，但在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍（10 μm：≤ 6000 個(gè)，25 μm：≤ 600 個(gè)）限度以內(nèi)。說明該抗體原液在最長相變時(shí)間 480 min 內(nèi)進(jìn)行凍融時(shí)，質(zhì)量較穩(wěn)定。

根據(jù)原液產(chǎn)量及每批次灌裝需求，放大后選用 1000 ml凍存瓶（分裝體積 ≤ 80%）分裝凍融，采用 -60 ℃ 冰箱冷凍和水浴解凍的方式，該條件下凍融時(shí)間約為 420 min，凍融時(shí)間小于 480 min，而相變時(shí)間更小，因此認(rèn)為在該條件下凍融原液質(zhì)量穩(wěn)定。最后結(jié)合凍融條件確定凍融工藝參數(shù)為：1 L 凍存瓶（分裝體積 ≤ 80%），冷凍條件為 -60 ℃冰箱，解凍條件為 20 ～ 30 ℃ 水浴。

放大后按照上述凍融參數(shù)進(jìn)行原液解凍后檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表5。

表5 放大后原液凍融檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，均符合原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，且與對(duì)照品相比，各質(zhì)量屬性均未發(fā)生明顯變化，說明該凍融工藝參數(shù)設(shè)定合理，凍融過程能夠保證原液穩(wěn)定性。

IgG4 突變型抗體原液，選用 1000 ml 凍存瓶進(jìn)行凍融工藝驗(yàn)證，設(shè)定冷凍條件為 -60 ℃ 冰箱，解凍條件分別設(shè)為（25 ± 2）℃ 水浴和（25 ± 2）℃ 室溫，凍融時(shí)間分別約為 420 min 和 600 min，相變時(shí)間約為 160 min 和380 min。樣品解凍后經(jīng)檢測(cè)，SEC-HPLC 聚體含量分別為0.7% 和 1.1%，前者較對(duì)照品相比聚體含量未有升高，后者升高 57.1%。而縮小模型實(shí)驗(yàn)顯示該 IgG4 突變型抗體在相變時(shí)間為 125 min 時(shí)，聚體含量未有變化，相變時(shí)間415 min 時(shí)，聚體含量較對(duì)照品增加 100%，放大后驗(yàn)證結(jié)果與縮小模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3 討論

根據(jù)本文相關(guān)研究，IgG1 野生型和 IgG1 突變型分子類型的抗體原液凍融時(shí)較穩(wěn)定，除不溶性微粒稍有增加外，其他質(zhì)量屬性均未見明顯變化；IgG1 突變型的三種不同蛋白濃度的原液凍融時(shí)，除不溶性微粒稍有增加外，其他質(zhì)量屬性并未隨蛋白濃度升高表現(xiàn)差異，說明 IgG1 突變型抗體原液的穩(wěn)定性在凍融時(shí)受蛋白濃度影響較?。籌gG4 突變型抗體原液凍融過程存在蛋白不穩(wěn)定現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，本文研究結(jié)果與文獻(xiàn)[5]報(bào)道結(jié)果相一致。有研究顯示，蛋白聚集一方面可能是多個(gè)蛋白質(zhì)分子通過非共價(jià)鍵（范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用）相連接；另一方面可能是通過二硫鍵等共價(jià)鍵相締合，稱為共價(jià)聚集[6]。這兩種聚集最終都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物。另，本研究所用 IgG4 突變型抗體原液制劑輔料中含有甘露醇，其在低溫凍結(jié)時(shí)容易結(jié)晶析出[7]，形成的疏水性界面易引起蛋白聚集，因此輔料的差異可能也是引起聚集體增加的原因之一，讀者可進(jìn)一步展開研究。

原液包裝形式、包裝規(guī)格和凍融條件的不同造成相變時(shí)間差異。同規(guī)格下在凍融袋中的相變時(shí)間小于凍存瓶，主要是因?yàn)閮鋈诖谋缺砻娣e大于凍存瓶，凍融過程中熱交換速率更快，蛋白在冰晶點(diǎn)停留的時(shí)間短，導(dǎo)致同等規(guī)格下凍融袋的聚體含量增加慢一些。此外凍融袋和凍存瓶材質(zhì)不同，可能也是影響熱交換速率的因素之一。隨著凍存瓶和凍融袋包裝規(guī)格的增大，相變時(shí)間變長，聚體含量也隨之增加。不同冷凍條件，產(chǎn)品質(zhì)量屬性未表現(xiàn)出明顯差異，可能和實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定冷凍相變時(shí)間變化太小有關(guān)，讀者可通過對(duì)凍融速率控制進(jìn)一步研究不同冷凍過程對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響；不同解凍條件，聚體含量產(chǎn)生明顯差異，且解凍越慢，相變時(shí)間越長，聚體含量增加越明顯。在解凍過程中，外周界面先發(fā)生熱交換，導(dǎo)致中心的溶質(zhì)產(chǎn)生濃縮，發(fā)生再結(jié)晶，再結(jié)晶對(duì)冰-液界面中的蛋白質(zhì)施加外界張力或剪切力，使蛋白質(zhì)發(fā)生損害，產(chǎn)生聚集。因此慢速解凍不利于蛋白活性的恢復(fù)，推薦進(jìn)行快速解凍。另，若解凍過程中有氣泡摻入也會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生不利影響，溫和的混勻?qū)p少再結(jié)晶，降低濃縮的影響[8-9]。

通過縮小模型確定凍融過程中蛋白質(zhì)量穩(wěn)定的相變時(shí)間，找到最大設(shè)計(jì)空間，使得在放大生產(chǎn)時(shí)所選凍融條件的相變時(shí)間落在設(shè)計(jì)空間內(nèi)，并有足夠的安全系數(shù)。IgG1 抗體原液通過小試研究，其凍融過程中蛋白質(zhì)量穩(wěn)定的相變時(shí)間較長，放大生產(chǎn)時(shí)安全系數(shù)較大，凍融條件更容易滿足。而 IgG4 突變型抗體原液蛋白質(zhì)量穩(wěn)定的相變時(shí)間較短，安全系數(shù)空間太小，放大生產(chǎn)時(shí)應(yīng)盡可能避免采用凍融工藝，若產(chǎn)品工藝必須采用凍融，應(yīng)采用全自動(dòng)凍融系統(tǒng)通過控制凍融速率或其他措施（如由凍存瓶更換為凍融袋，減小包裝規(guī)格等）嚴(yán)格控制相變時(shí)間。