實時熒光定量PCR 法檢測外源性DNA在重組III 型人源化膠原蛋白凍干纖維中的殘留

梁凱歌，孫丹丹

重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維作為國內(nèi)首個采用新型生物材料——重組人源化膠原蛋白制成的醫(yī)療器械，它的功能區(qū)具有 164.88° 柔性三螺旋結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列的重復(fù)單元與人類膠原的氨基酸序列特異性功能區(qū)一致，且生物相容性較好，其細(xì)胞的黏附性能優(yōu)于人類 I、III 型膠原蛋白，與自然膠原有相似的性能和穩(wěn)定性。與動物源性膠原相比，重組人源化膠原蛋白無病毒隱患、水溶性好、無排異反應(yīng)，具有良好的修復(fù)性能，主要用于面部真皮組織填充以糾正額部動力性皺紋（包括眉間紋、額頭紋和魚尾紋），預(yù)計在血管內(nèi)皮、子宮內(nèi)膜、創(chuàng)面、口腔黏膜修復(fù)及骨科等領(lǐng)域具有更廣闊的臨床應(yīng)用。

外源性 DNA 殘留具有潛在的致癌風(fēng)險，可能傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，并導(dǎo)致癌變或其他病理變化，藥品監(jiān)督管理部門對外源性 DNA 殘留量的要求非常嚴(yán)格[1]。重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維在研發(fā)生產(chǎn)過程中可能會產(chǎn)生自身相關(guān)或工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物，因其廣泛應(yīng)用于人體，而外源性 DNA 進(jìn)入人體后可能會導(dǎo)致基因突變，突變絕大多數(shù)會導(dǎo)致疾病，危害人體健康。因此，必須建立標(biāo)準(zhǔn)化外源性 DNA 殘留檢測方法，以滿足對生物醫(yī)藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的要求。

本研究利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)對重組III 型人源化膠原蛋白凍干纖維中的外源性 DNA殘留量進(jìn)行測定，并對該方法的線性、重復(fù)性和回收率進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維（批號：20201102、20201201、20201202、20210802、20210803、20210901、20210902、20210904，規(guī)格：4 mg/瓶），由山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒 I、II（磁珠法）、E.coli殘留 DNA 檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）及相應(yīng)引物和探針均為天津科佰迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，引物和探針序列如下：正向引物：5' CGCTGTAAGAGGACCGTAG 3'，反向引物：5' GACCTCACGCAATCTTCTGA 3'；探針：5' FAM-ACCGCTGCCTCCTCCTGCAGGMGB 3'。

1.1.3 儀器 BQHERO-32 Host rDNA 前處理系統(tǒng)為天津科佰迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；XK-400 型離心機(jī)、XK80-A 型快速混勻儀均為江蘇新康醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；SYG-1210 恒溫水浴鍋為美國精騏有限公司產(chǎn)品；Archimed X 系列實時熒光定量 PCR 儀為鯤鵬（徐州）科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備

1.2.1.1 待測樣本的制備 利用樣本前處理試劑盒中的樣本稀釋液將重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維溶解成 4 mg/ml 原液，即為待測樣本。

1.2.1.2 加標(biāo)回收質(zhì)控樣本的制備 取待測樣本100 μl，加至 1.5 ml 干凈的離心管中，加入 21 pg的E.colicontrol DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 用試劑盒中提供的 DNA稀釋緩沖液將E.colicontrol DNA 進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為 300、30、3、0.3 和 0.03 pg/μl。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 DNA 提取 按照宿主細(xì)胞殘留 DNA樣本前處理試劑盒進(jìn)行處理，在 1.2.1 制備的樣本中加入 10 μl 5 mol/L NaCl 溶液，用渦旋振蕩器充分振蕩 10 s；加入 15 μl 蛋白酶 K，在渦旋振蕩器上充分振蕩 10 s；配制新鮮的裂解液，其組成為：130 μl 裂解液/100 μl 樣本，9 μl 肝糖原/100 μl 樣本，0.2 μl tRNA/100 μl 樣本，充分混勻；將 139 μl新鮮配制的裂解液加入到樣本管中，然后用渦旋振蕩器充分振蕩 10 s，取出短暫快速離心 5 s，然后放置在 56 ℃ 孵育 30 min；孵育完成后的樣品在 BOHERO-32 Host rDNA 前處理系統(tǒng)中進(jìn)行核酸提取。

1.2.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測 參照E.coli殘留 DNA 檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）方法，通過 Archimed X 系列實時熒光定量 PCR 儀，分別取不同濃度的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和加標(biāo)回收樣本 10 μl，pre-mix（2 × Taqman master 15 μl，10 ×E.coliqPCR 3 μl，RNase-free H2O 2 μl）20 μl進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：50 ℃ 10 min，95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，45 個循環(huán)。每個樣品做 3 個復(fù)孔。

1.2.4 方法確認(rèn) 按照 1.2.3 對 3 批重組 III型人源化膠原蛋白凍干纖維（批號：20201102、20201201、20201202）進(jìn)行準(zhǔn)確性實驗和回收率實驗。加標(biāo)回收樣本測定值減去樣本測定值后除以加入的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即為回收率，回收率應(yīng)在50% ～ 150% 之間。

1.2.5 方法學(xué)驗證

1.2.5.1 重復(fù)性實驗 按照 1.2.3 對 5 批重組III 型人源化膠原蛋白凍干纖維（批號：20210802、20210803、20210901、20210902、20210904）進(jìn)行實驗，確定方法的重復(fù)性。

1.2.5.2 中間精密度實驗 由 3 名實驗員獨立檢測重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維的外源性 DNA 殘留量，每個待測樣本和加標(biāo)回收質(zhì)控樣本做 3 個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

2.1.1 qPCR 引物特異性 用 DNA 稀釋緩沖液將E.colicontrol DNA 進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋濃度依次為 300、30、3、0.3、0.03 pg/μl 的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線見圖1。由圖1 可知，擴(kuò)增的各個時期曲線良好，呈“S”形，且線條光滑平穩(wěn)，擴(kuò)增效率高，符合定量檢測的要求，引物具有特異性。

2.1.2 qPCR 定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線 以各質(zhì)量濃度（300、30、3、0.3、0.03 pg/μl）的E.colicontrol DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，利用標(biāo)準(zhǔn)品測得 Ct 值作為縱坐標(biāo) y，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/μl）取對數(shù)作為橫坐標(biāo) x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y = -3.3275x +26.921（R2= 0.9998），DNA 質(zhì)量濃度在 0.03 ～300 pg/μl 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) ＞ 0.99（圖2），說明本方法適用于 pg 級別的微量 DNA殘留檢測。

圖2 E.coli control DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 2 Standard curve of E.coli control DNA

2.2 方法確認(rèn)

取重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維 3 批（批號：20201102、20201201、20201202），按照1.2.3 進(jìn)行準(zhǔn)確性實驗和回收率實驗，實驗結(jié)果（表1）顯示 3 批樣品 DNA 殘留量均為 pg 級別，且回收率均在 50% ～ 150% 之間，符合質(zhì)量控制要求。

表1 樣品 DNA 殘留量和回收率實驗結(jié)果Table 1 Experimental results of sample DNA residue and recovery

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 重復(fù)性實驗

2.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定 為進(jìn)一步確定上述方法對重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維的適用性，以各質(zhì)量濃度（300、30、3、0.3、0.03 pg/μl）的 DNA 為模板再次進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，利用標(biāo)準(zhǔn)品測得 Ct 值作為縱坐標(biāo) y，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/μl）取對數(shù)作為橫坐標(biāo) x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = -3.3592x + 27.05（R2= 0.9999）， DNA 質(zhì)量濃度在 0.03 ～ 300 pg/μl 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) ＞ 0.99，確定引物具有特異性，E.colicontrol DNA 標(biāo)準(zhǔn)品適用于重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維。

2.3.1.2 qPCR 定量檢測樣品 取重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維5 批（批號：20210802、20210803、20210901、20210902、20210904），按照 1.2.3 進(jìn)行實驗，實驗結(jié)果（表2）顯示 5 批樣品外源性 DNA 殘留量除 1 批未檢出外，其余批次均為 pg 級別，回收率和回收率 RSD 均符合《中國藥典》2020年版 3407 外源性 DNA 殘留量測定法第三法的要求，方法具有可重復(fù)性，qPCR法可用于重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維外源性 DNA 殘留量檢測。

表2 重復(fù)性驗證結(jié)果Table 2 Repeatability verification results

2.3.2 中間精密度實驗 由 3 名實驗員獨立檢測重組 III 型人源化膠原蛋白凍干纖維的外源性DNA 殘留量，每個待測樣本和加標(biāo)回收質(zhì)控樣本做 3 個重復(fù)，根據(jù)實驗結(jié)果（表3）可看出，3 名實驗員測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好線性，樣本外源性 DNA 殘留量均為 pg 級別，測得加標(biāo)質(zhì)控樣本中回收率均在 75% 以上，3 名實驗員外源性DNA 殘留量的 RSD 為 11.59%，結(jié)果穩(wěn)定性好，中間精密度良好。

表3 中間精密度驗證結(jié)果Table 3 Intermediate precision verification results

3 討論

重組人源化膠原蛋白研發(fā)過程中，生產(chǎn)工藝除雜后仍有潛在的殘留 DNA 片段，這些殘留 DNA片段的大小和組成成分不明確，存在傳染性、致瘤性、免疫原性增加或致突變等潛在風(fēng)險，因此，外源性 DNA 殘留也是各國藥品監(jiān)管部門監(jiān)督管理的關(guān)鍵，基于安全質(zhì)量控制，必須對產(chǎn)品中外源性DNA 殘留量進(jìn)行檢測[2]。目前，已有多種檢測方法被用于重組蛋白產(chǎn)品中外源性 DNA 殘留的質(zhì)量控制?！吨袊幍洹?020年版中關(guān)于外源性 DNA殘留量的檢測方法有 3 種，DNA 探針雜交法、熒光染色法和定量 PCR 法。DNA 探針雜交法靈敏度高，但操作繁瑣且不能對 DNA 進(jìn)行定量；熒光染色法雖可對 DNA 進(jìn)行定量，但其靈敏度低，檢出限高，不適用于重組蛋白中微量 DNA 的檢測。近年來，已有多篇文章研究 qPCR 技術(shù)在外源性DNA 殘留量測定上的應(yīng)用，并都取得了較好的結(jié)果[3-4]。qPCR 法的技術(shù)優(yōu)勢在于序列特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、人為干擾因素少，可以為生物制藥行業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段。

外源性 DNA 殘留屬于微量雜質(zhì)，測定時受干擾因素較多，很難實現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測。確保產(chǎn)品中殘留 DNA 在提取過程中能被有效地提取，是采用 qPCR 對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量的前提。本實驗通過 BQHERO-32 Host rDNA 前處理系統(tǒng)，采用磁珠法提取 DNA，相較于傳統(tǒng)的 DNA 提取方法（離心柱法、介質(zhì)輔助離心法等），結(jié)合核酸自動提取儀的磁珠法在很大程度上減少了人為誤差，提高了檢測效率和檢測準(zhǔn)確性[5-6]。

根據(jù)《中國藥典》2020 版，外源性 DNA 殘留量應(yīng)不超過每劑 10 ng。檢測結(jié)果顯示，重組III 型人源化膠原蛋白凍干纖維殘留 DNA 處于pg 級別，遠(yuǎn)低于每劑 10 ng。本實驗所建立的外源性 DNA 殘留量檢測方法，經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn)，qPCR法的線性、回收率、準(zhǔn)確性均符合要求，且BQHERO-32 Host rDNA 前處理系統(tǒng)可實現(xiàn)微量DNA 的快速有效提取，該方法可有效用于重組膠原蛋白產(chǎn)品中外源性 DNA 殘留量的特異性檢測，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。