Secoemestrin C抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制研究

李楊，趙午莉，司書(shū)毅，陳明華，邵榮光

惡性腫瘤是威脅人類生命健康的重大慢性疾病，在所有惡性腫瘤中肺癌發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。近年來(lái)，我國(guó)男性和女性肺癌發(fā)病率均呈快速上升趨勢(shì)，而與大多數(shù)國(guó)家相比，中國(guó)的肺癌死亡率相對(duì)較高，占所有癌癥死亡人數(shù)的近 20%[2]。預(yù)計(jì) 2015 - 2030年間，中國(guó)的肺癌死亡率可能增加約 40%[3]。肺癌的發(fā)病通常十分隱匿，臨床確診時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)展至中晚期，患者生存期短。目前，對(duì)于肺癌的治療多采用放療、化療、手術(shù)和分子靶向治療等手段，但常伴有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥性等問(wèn)題[4]。因此迫切需要尋找毒性小，療效好的治療藥物。

Secoemestrin C（Sec C）是從微生物發(fā)酵液中分離出來(lái)的具有抗腫瘤活性的多硫代二酮哌嗪類化合物。已有研究表明，Sec C 對(duì)胰腺癌及胰腺癌耐藥細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用，可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)半胱氨酸殘基硫酸化并降解Yes 相關(guān)蛋白（YAP），引起胰腺癌細(xì)胞的凋亡[5]。但 Sec C 的抗肺腺癌活性還未被報(bào)道。本研究進(jìn)一步探討 Sec C 對(duì)于肺腺癌的增殖抑制作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肺腺癌細(xì)胞 A549、H1299 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；10000 U/ml 青霉素、10000 μg/ml 鏈霉素、PBS 均購(gòu)自中科邁晨科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；4% 多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）、細(xì)胞總蛋白的提取及定量所用的 RIPA 裂解液和 BCA試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；無(wú)水甲醇、DMSO 購(gòu)自北京化工廠；Western blot 所用一抗購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；發(fā)光液購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；5-乙炔基-2' 脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；N-乙酰半胱氨酸（NAC）購(gòu)自美國(guó) Selleck Chemical 公司；DAPI購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek 公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀為美國(guó) SpectraMax 產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法檢測(cè) Sec C 對(duì) A549 和 H1299細(xì)胞的殺傷活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549 和 H1299細(xì)胞，消化離心后，計(jì)數(shù)。按照每孔 5 × 103個(gè)/200 μl的密度接種于 96 孔板中，孔板邊緣用無(wú)菌 PBS緩沖液填充，以單加培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照。將孔板轉(zhuǎn)移至 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，各孔分別加入 Sec C 200 μl，對(duì)倍稀釋至 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μmol/L，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔。藥物作用 48 h后加入 5 mg/ml MTT 溶液 40 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h后，小心吸去上清，加入 DMSO 150 μl，振蕩 5 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定其在 490 nm 處的光密度值（OD490）。計(jì)算 Sec C 對(duì) A549 和 H1299 的半數(shù)抑制率（IC50）。

1.2.2 EdU 摻入試驗(yàn) A549 和 H12199 細(xì)胞分別用 0.5 μmol/L Sec C 處理24 h 后加入適量 EdU工作液孵育 3 h，進(jìn)行 EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 4% 多聚甲醛固定、清洗、EdU 反應(yīng)、DAPI 染色等步驟完成實(shí)驗(yàn)，使用熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 和H1299 細(xì)胞消化離心后，計(jì)數(shù)。按照每孔 1000 個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，24 h 后待細(xì)胞貼壁后換液，并用不同濃度的 Sec C 處理 7 d。用 PBS 清洗細(xì)胞后，加甲醇室溫固定 15 min，加結(jié)晶紫染色15 min，吸去染色液，PBS 漂洗至背景透明，風(fēng)干拍照。以大于 50 個(gè)細(xì)胞/集落為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（細(xì)胞集落數(shù)/初始接種細(xì)胞數(shù)）× 100%。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) 將細(xì)胞以 3 × 105個(gè)/孔的密度接種于六孔板，用不同濃度的 Sec C 處理24 h，同時(shí)設(shè)置不含 Sec C 的對(duì)照組，隨后收集細(xì)胞用 RIPA 裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min 后取上清，并用 BCA 試劑進(jìn)行蛋白定量。各取 25 μg 總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，電泳完成后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉；一抗（1∶1000）4 ℃ 過(guò)夜孵育，次日使用 1∶5000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育 2 h，化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像儀掃描拍照。

1.2.5 NAC 部分逆轉(zhuǎn) Sec C 引起的增殖抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以適宜數(shù)量接種于平板中，用 25 μmol/L NAC 與不同濃度的 Sec C共同作用。EdU 摻入實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Western blot 檢測(cè) NAC 對(duì) Sec C 引起的增殖抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sec C 能夠有效殺傷肺腺癌細(xì)胞

Sec C 與肺腺癌 A549 和 H1299 細(xì)胞共同孵育 3 h 后，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始聚集并逐漸變圓；處理 6 h 后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征發(fā)生明顯變化；至24 h，可觀察到細(xì)胞膜局部破損、細(xì)胞內(nèi)容物泄出等現(xiàn)象（圖1A）。結(jié)果表明 Sec C 能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速殺傷肺腺癌細(xì)胞。

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sec C 對(duì) A549 細(xì)胞和H1299 細(xì)胞的 IC50分別為（2.164 ± 0.583）μmol/L和（2.341 ± 0.098）μmol/L（圖1B），具有較強(qiáng)的增殖抑制作用。

采用 EdU 摻入法檢測(cè) Sec C 對(duì) DNA 復(fù)制的影響。與對(duì)照組相比，0.5 μmol/L Sec C 處理 24 h后，EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低，約為對(duì)照細(xì)胞的33.2%（圖1C），表明 Sec C 對(duì) DNA 復(fù)制具有明顯的抑制作用。

進(jìn)一步，采用平板克隆形成法驗(yàn)證 Sec C 對(duì)增殖的抑制作用。A549 細(xì)胞和 H1299 細(xì)胞用不同濃度的 Sec C 孵育 7 d，結(jié)果顯示 Sec C 以劑量依賴的方式抑制肺腺癌細(xì)胞的克隆形成（圖1D）。當(dāng)濃度為 0.8 μmol/L 時(shí)，處理細(xì)胞克隆形成率約為對(duì)照細(xì)胞的 42.3%。

圖1 Sec C 能夠有效殺傷肺腺癌細(xì)胞（A：A549 和 H1299 細(xì)胞經(jīng) 2 μmol/L Sec C 作用不同時(shí)間點(diǎn)后觀察細(xì)胞形態(tài)；B：MTT 法檢測(cè)不同濃度的 Sec C 作用于 A549 和 H1299 48 h 后的細(xì)胞存活率；C：EdU 摻入法檢測(cè)經(jīng) 0.5 μmol/L Sec C作用 24 h 后 A549 和 H1299 的細(xì)胞增殖；D：A549 和 H1299 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的 Sec C 作用 7 d 后的克隆形成能力；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 1 Sec C was effective in killing lung adenocarcinoma cells (A: Cell morphology of A549 and H1299 cells after 2 μmol/L Sec C at different time points; B: Cell survival rate of A549 and H1299 after 48 h of Sec C at different concentrations by MTT; C: Cell proliferation of A549 and H1299 after 24 h of 0.5 μmol/L Sec C by EdU assay; D: Colony ability of A549 and H1299 cells after 7 d of Sec C at different concentrations; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001)

2.2 Sec C 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

有報(bào)道，Sec C 可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5]，而異常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡[6]。Western blot 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Sec C 能夠促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 BiP、p-eIF2α、IRE1α、ATF4 的表達(dá)增多，激活 IRE1α/eIF2α/ATF4 信號(hào)通路以抑制整體蛋白質(zhì)的合成，且呈時(shí)間依賴和濃度依賴（圖2）；同時(shí)，與對(duì)照組相比，Sec C 也使得PARP、caspase3 和 caspase7 蛋白水平降低，cleaved-PARP、cleaved-caspase3 和 cleaved-caspase7蛋白水平升高（圖3），提示激活了 caspase 凋亡通路。

圖2 Sec C 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)（A：A549 細(xì)胞；B：H1299 細(xì)胞；C：A549 細(xì)胞經(jīng) 8 μmol/L Sec C 作用；D：H1299 細(xì)胞經(jīng) 1 μmol/L Sec C 作用）Figure 2 Sec C induced expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in lung adenocarcinoma cells (A: A549 cells;B: H1299 cells; C: A549 cells treated with 8 μmol/L Sec C; D: H1299 cells treated with 1 μmol/L Sec C)

圖3 Sec C 誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（A：A549 細(xì)胞；B：H1299 細(xì)胞；C：A549 細(xì)胞經(jīng) 8 μmol/L Sec C 作用；D：H1299 細(xì)胞經(jīng) 1 μmol/L Sec C 作用）Figure 3 Sec C induced expression of apoptosis-related proteins in lung adenocarcinoma cells (A: A549 cells; B: H1299 cells;C: A549 cells treated with 8 μmol/L Sec C; D: H1299 cells treated with 1 μmol/L Sec C)

2.3 NAC 部分逆轉(zhuǎn) Sec C 引起的增殖抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡

前期研究證明，Sec C 可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上豐富的半胱氨酸殘基硫化形成二硫鍵，從而阻斷硫醇蛋白平衡并誘導(dǎo)未折疊蛋白效應(yīng)[5]。我們加入半胱氨酸衍生物 NAC 斷裂二硫鍵或取代蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基來(lái)發(fā)揮其還原活性[7]。EdU 摻入法和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明，在 Sec C 處理的細(xì)胞中加入 NAC后，NAC 可以部分逆轉(zhuǎn) Sec C 引起的增殖抑制（圖4）；Western blot 結(jié)果表明，NAC 可抑制Sec C 誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及 caspase 凋亡通路相關(guān)蛋白的激活（圖5）。

圖4 NAC 部分逆轉(zhuǎn) Sec C 引起的增殖抑制（A：EdU 摻入法檢測(cè) A549 和 H1299 細(xì)胞經(jīng) 0.5 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后的細(xì)胞增殖；B：A549 和 H1299 細(xì)胞分別經(jīng) 0.6、0.1 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用7 d，檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力； **P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 4 NAC partially reversed Sec C-induced proliferation inhibition (A: EdU assay to detect cell proliferation of A549 and H1299 cells after 0.5 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 24 h; B: A549 and H1299 cells were subjected to 0.6 and 0.1 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 7 d, respectively, to detect the colony ability of the cells; **P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001)

圖5 NAC 部分逆轉(zhuǎn) Sec C 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡（A：A549 細(xì)胞經(jīng) 8 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)；B：H1299 細(xì)胞經(jīng) 1 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)；C：A549 細(xì)胞經(jīng) 8 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后，細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；D：H1299 細(xì)胞經(jīng) 1 μmol/L Sec C 與 25 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后，細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)）Figure 5 NAC partially reversed Sec C-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis (A: Expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in A549 cells after 8 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 24 h; B: Expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in H1299 cells after 1 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 24 h;C: Expression of apoptosis-related proteins in A549 cells after 8 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 24 h;D: Expression of apoptosis-related proteins in H1299 cells after 1 μmol/L Sec C co-administered with 25 μmol/L NAC for 24 h)

3 討論

天然藥物資源豐富，已經(jīng)成為了抗癌藥物的重要來(lái)源[8]。源自天然來(lái)源的化合物由于其藥效團(tuán)的多樣性和新的作用機(jī)制表現(xiàn)出更好的生物活性和低毒性，已成為開(kāi)發(fā)新藥及先導(dǎo)化合物的寶藏[9]。Sec C 是從真菌 1454 大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取出的一種多硫代二酮哌嗪類化合物，能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。

自 1997年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，Sec C 對(duì)多種癌癥均表現(xiàn)出良好的抑制作用。本研究首次評(píng)估了 Sec C 對(duì)肺腺癌細(xì)胞的影響，并初步闡明了其發(fā)揮抗肺腺癌作用的潛在機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn) Sec C 能夠有效抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)激，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和加工的重要場(chǎng)所[10]。當(dāng)其受到外界刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，引起未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[11]。在未折疊蛋白反應(yīng)過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 BiP 可結(jié)合未折疊蛋白，避免其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，BiP 的過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)志性事件之一[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生功能紊亂后，激活 eIF2α 引起 eIF2α 上的 N 端第51 位絲氨酸磷酸化，從而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤蛋白的折疊與聚集[13]。IRE1α 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生功能紊亂初期，IRE1α 通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子 XBP1 的生成[14]，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)發(fā)生，eIF2α 持續(xù)磷酸化，IRE1α 持續(xù)激活，誘導(dǎo)ATF4 產(chǎn)生，導(dǎo)致多種 mRNA 降解，蛋白質(zhì)合成受阻，發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到一系列信號(hào)刺激后發(fā)生的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程[15]。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。在凋亡因子的作用下，caspase 酶原受到切割形成有活性的蛋白水解酶，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生命活動(dòng)所必需的蛋白進(jìn)行裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。caspase3 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，PARP 作為 caspase3 下游的信號(hào)分子，當(dāng)大量氧化劑或自由基存在時(shí)，PARP 被過(guò)度激活，引起ATP 的過(guò)度消耗，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Sec C 處理后細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 BiP、ATF4、IRE1α、p-eIF2α 蛋白表達(dá)水平顯著升高，凋亡相關(guān)蛋白caspase3、caspase7、PARP 蛋白表達(dá)水平顯著降低。加入半胱氨酸衍生物 NAC 后，與 Sec C 組相比，細(xì)胞的增殖抑制作用得到部分逆轉(zhuǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著回降。提示 Sec C通過(guò)持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活 IRE1α-p-eIF2α-ATF4通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Sec C 可抑制肺腺癌 A549 和H1299 細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與使 IRE1α、p-eIF2α 蛋白激活，ATF4 表達(dá)增多，引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。Sec C 作為一種新型的抗腫瘤化合物表現(xiàn)出良好的抗肺腺癌活性，有望成為治療肺腺癌的候選化合物。