lncRNA NNT-AS1對膀胱癌細胞增殖、轉移及腫瘤干細胞干性的影響與機制研究

廖林輝，陳華平，范國斌，段鈺澤 (.海南省萬寧市人民醫(yī)院泌尿外科，海南 萬寧 57500；.海南醫(yī)學院基礎醫(yī)學與生命科學學院，海南 ?？?5799)

膀胱癌是起源于膀胱上皮黏膜組織的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，男性發(fā)病率高，且發(fā)病率在逐年升高，雖然目前腫瘤的治療技術在不斷進步，但是膀胱癌容易復發(fā)和轉移，患者預后較差，并且膀胱癌的發(fā)病機制復雜，但其具體機制尚不清楚，因此，需要進一步探究其發(fā)生發(fā)展的機制，發(fā)現(xiàn)膀胱癌診斷和治療的新靶點[1-3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA，不具備編碼功能，但是可通過多種途徑調控腫瘤等疾病的病理進程，包括腫瘤的血管新生、生長和轉移、免疫逃逸、腫瘤干性等[4-6]。目前，已有多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)可調控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，如lncRNA CASC1和lncRNA GClnc1具有調控膀胱癌生長和轉移的能力，并有研究指出lncRNA具有診斷和治療膀胱癌的潛力，因此需要挖掘更多對膀胱癌具有調控功能的lncRNA[7-8]。lncRNA NNT-AS1是一類在多種腫瘤中高表達的lncRNA，有研究指出其對肺癌、膠質瘤等在多種腫瘤進程均有調控作用[9-10]。而lncRNA NNT-AS1對膀胱癌的復發(fā)和轉移的影響目前尚不清楚，本研究探究lncRNA NNT-AS1對膀胱癌細胞增殖、轉移、腫瘤干細胞干性的影響，旨在為膀胱癌的復發(fā)和轉移研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1和人膀胱癌細胞UM-UC-3、5637、TCC-SUP、T24購自美國ATCC細胞庫；PrimeScriptTM試劑盒購自日本TAKARA公司(批號：AI21034A)、PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix(批號：A25741)購自購自美國ThermoFisher公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(批號：11668030)購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑盒(批號：WLA074)購自沈陽萬類生物科技有限公司；CD44(批號：37259)、CD133(批號：64326)、NCKAP1(批號：34325)、YAP(批號：14074)、TAZ(批號：83669)、ALDH1A1(批號：36671)、Oct4(批號：2750)、Nanog(批號：8822)、GAPDH(批號：5174)抗體和山羊抗兔IgG(批號：4417)購自美國Cell Signaling Technology公司。4～6周齡的雌性Balb/c裸鼠12只購自卡文斯實驗動物技術有限公司[實驗動物質量合格證：SCXK(瓊)2019-0016]。

1.2 細胞培養(yǎng)

將細胞SV-HUC-1、UM-UC-3、5637、TCC-SUP、T24培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合率達80%時進行細胞傳代。

1.3 膀胱癌干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

T24細胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中，添加20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、20 ng/mL表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、5 μg/mL胰島素和2%無血清添加劑B27，培養(yǎng)至形成大體積懸浮球體時進行傳代。

1.4 qRT-PCR

使用TRIzol法提取細胞總RNA，根據PrimeScriptTM試劑盒和PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix分別進行逆轉錄反應和qRT-PCR反應，記錄CT值，使用2-△△CT法計算lncRNA NNT-AS1和miR-582-5p的相對表達量，引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.5 細胞轉染與分組

將T24細胞和膀胱癌干細胞分為sh-NC組(轉染sh-NC)、sh-NNT-AS1組(轉染sh-NNT-AS1)、Control組(共轉染sh-NC、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(共轉染sh-NNT-AS1、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(共轉染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組(共轉染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和NCKAP1小干擾RNA)，根據LipofectamineTM2000轉染試劑盒，按照上述分組進行轉染，轉染24 h后，將各組細胞培養(yǎng)液更換為新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.6 CCK8檢測各組細胞增殖能力

將各組細胞稀釋至2×104/mL，96孔板每孔接種100 μL，細胞置于培養(yǎng)箱中，分別在0 h、24 h、48 h和72 h取出對應的孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育4 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力

將各組細胞用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至1×105/mL，取100 μL接種至Transwell小室中，小室下層浸沒于含600 μL 10% FBS的RPMI-1640的24孔板中，24孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將小室底部用無水甲醛固定30 min，結晶紫染色，清洗后觀察細胞遷移和侵襲數(shù)。

1.8 膀胱癌干細胞成球實驗

將膀胱癌干細胞用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋至5×103/mL，在吸附性低的24孔板中每孔接種600 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，每周更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并記錄各組細胞成球能力。

1.9 流式細胞術檢測CD133和CD44表達

膀胱癌干細胞重懸成單細胞懸液，每管中加入1×105個細胞，加入5 μL FITC-CD44和PE-CD133抗體并設置單染對照管，避光孵育30 min，檢測各組細胞CD133和CD44表達。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗

StarBase數(shù)據庫預測lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的結合位點，用LipofectamineTM2000轉染試劑盒將lncRNA NNT-AS1過表達質粒(lncRNA NNT-AS1 WT)、突變質粒(lncRNA NNT-AS1 MUT)及空白質粒(Vector)轉染至HEK 293T細胞，然后分別將miR-NC和miR-582-5p mimic轉染至上述細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

TargetScan數(shù)據庫預測miR-582-5p與NCKAP1的結合位點，用LipofectamineTM2000轉染試劑盒將NCKAP1質粒(NCKAP1 WT)、突變質粒(NCKAP1 MUT)及空白質粒(Vector)轉染至HEK 293T細胞，然后分別將miR-NC和miR-582-5p mimic轉染至上述細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.11 Western blot

RIPA蛋白提取試劑盒提取各組細胞的總蛋白，取10 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(80 V電泳2 h)，轉膜(300 mA轉膜1 h)，封閉2 h，PVDF膜與NCKAP1、YAP、TAZ、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog和GAPDH一抗(均按1∶1 000的比例稀釋)于4 ℃孵育過夜，TBST清洗，按1∶2 000的比例稀釋二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL試劑盒顯影，拍照，并對曝光結果進行定量分析。

1.12 小鼠體內成瘤實驗

4～6周齡的雌性Balb/c裸鼠12只，隨機分為 4組，每組3只，飼養(yǎng)于溫度25 ℃、濕度50%、12 h明暗交替的SPF級動物房中，隔天更換墊料及飲用水。取Control組、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組T24細胞用生理鹽水稀釋至1×108/mL，然后于各組小鼠右側腋下接種100 μL細胞懸液。接種后，每2 d使用游標卡尺測量腫瘤長(a)和寬(b)，計算小鼠腫瘤體積(V)，腫瘤體積計算公式為：V=0.5×a×b2。接種20 d后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取瘤組織。

1.13 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 lncRNA NNT-AS1在膀胱癌細胞中高表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1比較，人膀胱癌細胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP中l(wèi)ncRNA NNT-AS1顯著增加(P<0.001)，見圖1a。說明lncRNA NNT-AS1高表達于膀胱癌細胞。為了探究lncRNA NNT-AS1對膀胱癌的影響，在lncRNA NNT-AS1表達最高的T24細胞中轉染lncRNA NNT-AS1 shRNA(sh-NNT-AS1組)和si-lncRNA NNT-AS1 negative control(sh-NC組)，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達顯著下調(P<0.05)，見圖1b。

a：qRT-PCR檢測各細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達；b：qRT-PCR檢測轉染后各組細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達 *：與SV-HUC-1比較，P<0.05；#：與sh-NC組比較，P<0.05圖1 qRT-PCR檢測lncRNA NNT-AS1表達

2.2 lncRNA NNT-AS1調控膀胱癌細胞的增殖和遷移能力

與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細胞的OD值在24 h、48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，見圖2a。說明抑制lncRNA NNT-AS1可顯著抑制膀胱癌細胞的增殖能力。細胞遷移和侵襲檢測結果顯示，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2b。說明抑制lncRNA NNT-AS1表達可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力。

a：CCK8檢測各細胞增殖能力；b：Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲能力(×20) #：與sh-NC組比較，P<0.05圖2 lncRNA NNT-AS1調控膀胱癌細胞的增殖和遷移能力

2.3 抑制lncRNA NNT-AS1對膀胱癌干細胞干性的影響

干細胞成球實驗檢測結果顯示，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組膀胱癌干細胞成球數(shù)顯著減少(圖3a)。Western blot檢測結果顯示，sh-NNT-AS1組膀胱癌干細胞標志物CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖3b。流式細胞術檢測結果顯示，sh-NNT-AS1組CD44+CD133+的細胞比例顯著低于sh-NC組(P<0.05)，見圖3c。說明抑制lncRNA NNT-AS1可抑制膀胱癌干細胞干性。

a：細胞成球實驗檢測膀胱癌干細胞干性(×10)；b：Western blot檢測各組細胞CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達；c：流式細胞術鑒定CD44+CD133+的細胞比例 #：與sh-NC組比較，P<0.05圖3 lncRNA NNT-AS1調控膀胱癌干細胞干性

2.4 lncRNA NNT-AS1對miR-582-5p/NCKAP1分子軸的影響

通過數(shù)據庫StarBase預測到lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的結合位點(圖4a)。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，在lncRNA NNT-AS1 WT細胞中，與miR-NC組比較，轉染miR-582-5p mimic細胞熒光強度顯著下降(P<0.05)；而在Vector和lncRNA NNT-AS1 MUT細胞中，轉染miR-NC和miR-582-5p mimic后細胞熒光強度無顯著變化(P>0.05)，見圖4b。qRT-PCR檢測結果顯示，抑制T24細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達后，細胞中miR-582-5p表達顯著上調(P<0.05)，見圖4c。說明lncRNA NNT-AS1可靶向調控miR-582-5p的表達。

通過TargetScan數(shù)據庫預測到miR-582-5p與NCKAP1結合位點(圖4d)。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，在NCKAP1 WT細胞中，與miR-NC組比較，轉染miR-582-5p mimic細胞熒光強度顯著下降(P<0.05)；而在Vector和NCKAP1 MUT細胞中，轉染miR-NC和miR-582-5p mimic后細胞熒光強度無顯著變化(P>0.05)，見圖4e。轉染miR-582-5p mimic后T24細胞中NCKAP1表達顯著下調(P<0.05)，轉染miR-582-5p inhibitor后T24細胞中NCKAP1表達顯著上調P<0.05)，見圖4f。說明miR-582-5p可靶向調控NCKAP1的表達。

a：lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p結合位點的預測；b：雙熒光素酶報告基因實驗驗證lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的靶向關系；c：qRT-PCR檢測各組細胞中miR-582-5p的表達；d：miR-582-5p與NCKAP1結合位點的預測；e：雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-582-5p與NCKAP1的靶向關系；f：Western blot檢測各組細胞中NCKAP1表達 *：與sh-NC組比較，P<0.05；#：與miR-NC組比較，P<0.05圖4 lncRNA NNT-AS1調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸

2.5 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

細胞增殖、遷移和侵襲檢測結果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組細胞OD值顯著下調(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)；與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組細胞OD值上調(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.05)；與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組細胞OD值顯著下調(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖5。說明lncRNA NNT-AS1通過調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌細胞的增殖和遷移。

a：CCK8檢測各組細胞增殖能力；b：Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲能力(×20) *:與Control組比較，P<0.05；#:與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△:與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖5 lncRNA NNT-AS1調控膀胱癌細胞增殖和遷移的能力

2.6 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對膀胱癌干細胞干性的影響

干細胞成球實驗結果顯示，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組膀胱干細胞成球數(shù)，膀胱癌干細胞標志物CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達及CD44+CD133+的細胞比例均顯著低于Control組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組膀胱干細胞成球數(shù)，CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達及CD44+CD133+的細胞比例均顯著高于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組膀胱干細胞成球數(shù)，CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達及CD44+CD133+的細胞比例均顯著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖6。說明lncRNA NNT-AS1通過調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌干細胞干性。

a：細胞成球實驗檢測膀胱癌干細胞干性；b：Western blot檢測各組細胞CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達；c：流式細胞術鑒定CD44+CD133+的細胞比例 *:與Control組比較,P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖6 lncRNA NNT-AS1調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而促進膀胱癌干細胞干性

2.7 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對小鼠體內成瘤的影響

小鼠體內成瘤實驗檢測結果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組小鼠腫瘤體積顯著減小(P<0.05)，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組小鼠腫瘤體積顯著大于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組小鼠腫瘤體積顯著小于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖7。說明lncRNA NNT-AS1調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌細胞在小鼠體內的增殖。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖7 小鼠體內成瘤實驗檢測結果

2.8 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對Hippo-YAP/TAZ信號通路的影響

Western blot檢測結果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組T24細胞NCKAP1、YAP、TAZ表達顯著降低(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組細胞NCKAP1、YAP、TAZ表達顯著高于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組細胞NCKAP1、YAP、TAZ表達顯著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖8。說明lncRNA NNT-AS1調控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而激活Hippo-YAP/TAZ信號通路。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖8 lncRNA NNT-AS1激活Hippo-YAP/TAZ信號通路

3 討論

膀胱癌是一類多發(fā)于男性的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其早期的病理特征不明顯，并且缺乏有效的腫瘤診斷標志物，使得其常在確診時就已經處于中晚期，因此需要探究更多用于膀胱癌診斷和治療的新靶點以及標志物[11-12]。近年來，許多非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)能夠促進或者抑制多種腫瘤的病理進程，其中l(wèi)ncRNA是一類對腫瘤具有廣泛的調節(jié)作用、且有望成為腫瘤診斷和治療新靶點的非編碼RNA[13]。lncRNA不具備編碼蛋白質的功能，但是可在表觀遺傳的層面調控腫瘤細胞的惡性生物學行為，包括腫瘤的生長、轉移、免疫逃逸、腫瘤耐藥、放療抗性等[14-15]。在膀胱癌的研究中，也有多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)具有重要的調控功能，如Wang等[16]和Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA GClnc1和lncRNA CCAT1均在膀胱癌中高表達，并且可促進膀胱癌的生長和轉移，發(fā)現(xiàn)更多具有調控功能的lncRNA有助于膀胱癌診斷和治療靶點的篩選。

lncRNA NNT-AS1在多種腫瘤中差異表達，lncRNA NNT-AS1高表達于肺癌、膠質瘤[9-10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1在膀胱癌細胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP中高表達，提示lncRNA NNT-AS1也可能具有調控膀胱癌發(fā)生發(fā)展的能力。所以本研究選擇lncRNA NNT-AS1表達水平最高的T24細胞進行后續(xù)實驗，發(fā)現(xiàn)轉染shRNA抑制T24細胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1的表達后，T24細胞增殖、遷移和侵襲能力以及膀胱癌干細胞的干性亦顯著降低，說明lncRNA NNT-AS1能夠調控膀胱癌細胞惡性生物學行為。He等[18]和Huang等[19]等也發(fā)現(xiàn)lncRNA NNT-AS1可促進非小細胞肺癌和膽管癌的增殖、遷移和侵襲。

在調控機制上，lncRNA NNT-AS1可結合于其靶向的miRNA抑制靶基因的表達，而miRNA又可結合于其靶基因的3’UTR區(qū)，進而抑制靶基因的翻譯，即lncRNA能夠調控miRNA/mRNA信號軸[20]。有研究表明，lncRNA NNT-AS1可調控miR-142-5p/SOX4分子軸從而調控胃癌的發(fā)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調控miR-582-5p/NCKAP1軸，并且lncRNA NNT-AS1可通過抑制miR-582-5p而上調NCKAP1的表達，進而調控T24細胞增殖、遷移、侵襲以及干細胞干性。同樣，此類調控機制也在肝癌中被發(fā)現(xiàn)，如Lu等[22]發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調控miR-363/CDK6軸進而影響肝癌細胞的生長。

NCKAP1可通過多種途徑調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Zhu等[23]研究發(fā)現(xiàn)NCKAP1可調控Hippo-YAP/TAZ信號通路而影響非小細胞肺癌的生長和轉移。Hippo信號通路具有高保守性，YAP和TAZ是重要的同源轉錄共刺激因子，二者可在Hippo信號通路下游發(fā)揮關鍵的作用，Hippo信號通路激活后，通過激酶的級聯(lián)反應磷酸化YAP和TAZ，進而抑制YAP和TAZ轉移至細胞核，而Hippo信號通路的抑制可促進非磷酸化的YAP和TAZ轉移至細胞核內，并與細胞核內TEAD等下游靶基因結合，進而促進細胞的增殖和轉移[24]。本研究預測并驗證后發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調控miR-582-5p/NCKAP1軸進而激活Hippo-YAP/TAZ信號通路。有研究表明，Linc00673可調控miR-515-5p/MARK4/Hippo信號通路而影響乳腺癌的增殖[25]。因此，本研究推測lncRNA NNT-AS1可通過激活Hippo-YAP/TAZ信號通路而調控膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及腫瘤干細胞干性。但是lncRNA NNT-AS1是否能成為膀胱癌診斷和治療的新靶點，還需進一步驗證。