血清TLR4 水平與肺癌化療后骨髓抑制的 相關(guān)性分析

劉夢瑤 羅蓮 陳梓林 顏磊 周娜 陳勇

肺癌是發(fā)生于肺部的惡性腫瘤,其發(fā)病率與病死率近年來均排在我國惡性腫瘤的第1 位。多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)到了晚期,失去最佳治療的時(shí)機(jī)。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥依舊是當(dāng)下治療非小細(xì)胞肺癌患者的主要方案［1,2］。骨髓抑制是臨床上化療最常見的劑量限制副反應(yīng)?；煏?huì)消耗大量的骨髓祖細(xì)胞,出現(xiàn)骨髓纖維化、抑制成熟血細(xì)胞釋放、骨髓功能抑制等,患者發(fā)生骨髓抑制后可能出現(xiàn)疲勞、出血、發(fā)熱等癥狀,導(dǎo)致治療延遲、減少藥物劑量等,均會(huì)影響治療效果,增加治療成本［3-5］。血清TLR4 是重要的先天免疫的受體之一,TLR4 及其相關(guān)信號(hào)參與了造血穩(wěn)態(tài)和造血疾病發(fā)?。?,7］。因此考慮TLR4 參與了化療后骨髓抑制的相關(guān)機(jī)制。故本文將邵陽市中心醫(yī)院2022 年1～8 月收治的93 例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象,探討血清TLR4 與化療后骨髓抑制的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022 年1～8 月邵陽市中心醫(yī)院收治的93 例非小細(xì)胞肺癌患者,年齡40～80 歲；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌55 例,腺癌38 例；臨床分期均采用TNM 分期第8 版。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①病理學(xué)檢查確診為非小細(xì)胞肺癌；②病歷資料完整；③化療方案為鉑類為基礎(chǔ)的雙藥化療；④充分的骨髓造血功能；⑤體力評(píng)分>70 分；⑥血常規(guī)、心肌酶學(xué)、肝腎功能、凝血功能等未見明顯異常。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并其他惡性腫瘤患者；②有凝血功能障礙、血液系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等患者；③合并其他感染性疾病患者；④合并精神疾病或癡呆患者；⑤合并骨轉(zhuǎn)移患者；⑥有化療禁忌證,合并其他器官功能損傷不能接受化療的患者。

1.4 方法

1.4.1 臨床資料收集 利用病歷系統(tǒng)收集患者年齡、性別、病理類型、體質(zhì)量指數(shù)等資料。

1.4.2 血常規(guī) 采集患者清晨6 點(diǎn)的外周血,選擇全自動(dòng)血液分析儀檢測血常規(guī)。

1.4.3 TLR4 血清水平 采集患者清晨6 點(diǎn)外周靜脈血,離心得血清。運(yùn)用人酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司)檢測血清TLR4水平。標(biāo)準(zhǔn)品的加樣: 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl。加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl,然后再加待測樣品10 μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部。加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl,空白孔除外。溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60 min。配液:將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍 稀釋后備用。洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s 后棄去,如此重復(fù)5 次,拍干。顯色:每孔先加入顯色劑A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,37℃避光顯色15 min。終止:每孔加終止液 50 μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測定:以空白孔調(diào)零,460 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 骨髓抑制發(fā)生情況 骨髓抑制分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí),判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。其中0 級(jí)代表無,Ⅰ+Ⅱ級(jí)代表輕度,Ⅲ+Ⅳ級(jí)代表重度。

表1 骨髓抑制判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 化療前后血清TLR4 水平 酶聯(lián)免疫吸附測定法實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：用標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的直線回歸方程式Y(jié)=-3.503+96.340X,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析?；熐昂骉LR4 水平比較運(yùn)用直線相關(guān)分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓抑制發(fā)生情況分析 93 例中晚期非小細(xì)胞肺癌患者中共發(fā)生骨髓抑制78 例(83.9%),其中0 級(jí) 15 例(16.1%),Ⅰ級(jí)21 例(22.6%),Ⅱ級(jí)40 例(43.0%),Ⅲ級(jí)11 例(11.8%),Ⅳ級(jí)6 例(6.5%)。

2.2 臨床特征分析 患者年齡<65 歲、體質(zhì)量指數(shù)<18.5 kg/m2的骨髓抑制程度與年齡≥65 歲、體質(zhì)量指數(shù)≥18.5 kg/m2比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同性別、KPS 評(píng)分、病理分型的骨髓抑制程度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 臨床特征分析(n)

2.3 化療前后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度的相關(guān)性分析 化療前,患者血清TLR4+的骨髓抑制程度與血清TLR4-比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；化療后,血清TLR4+的骨髓抑制程度與血清TLR4-比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；化療后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度呈正相關(guān)(r=0.540,P<0.05)。見表3,表4,圖1。

圖1 化療前后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度的相關(guān)性分析

表3 化療前血清TLR4+與血清TLR4-骨髓抑制程度比較(n)

表4 化療后血清TLR4+與血清TLR4-骨髓抑制程度比較(n)

3 討論

國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示,我國肺癌發(fā)病率及死亡率逐年上升?；熉?lián)合其他治療的綜合方案依舊是目前非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段［8］。骨髓抑制是化療主要的劑量限制性副反應(yīng),不僅會(huì)引發(fā)患者貧血、發(fā)熱等,更會(huì)影響患者治療效果［9］。

免疫系統(tǒng)是由復(fù)雜的分子和細(xì)胞機(jī)制組成,先天免疫是身體機(jī)能抵御內(nèi)外部威脅的第一道防線?；趯?duì)微生物病原相關(guān)分子模式(PAMPs)、損傷相關(guān)的分子模式(DAMPs)和適應(yīng)性免疫的認(rèn)識(shí),并通過產(chǎn)生大量因子介導(dǎo)由B 細(xì)胞主導(dǎo)的免疫活動(dòng)［10］。先天免疫的主要分子傳感器是模式識(shí)別受體(PRR),這是一種大蛋白類別,其中最重要的是血清Toll 樣受體［11］。血清TLR4 是先天免疫的受體之一,在脂多糖(LPS)刺激下誘導(dǎo)下游因子聚集激活,最后能夠促進(jìn)促炎因子的表達(dá),包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)等［12］。據(jù)報(bào)道,在暴露于LPS 或細(xì)菌后,血清TLR4 可發(fā)出依賴于非造血細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo),如內(nèi)皮細(xì)胞,其分泌粒細(xì)胞集落巨噬細(xì)胞刺激因子 (G-CSF),可通過誘導(dǎo)祖細(xì)胞進(jìn)入骨髓譜系刺激粒細(xì)胞前體增殖的細(xì)胞因子,從而促進(jìn)粒細(xì)胞的生成［13-15］。血清TLR4 可以在缺血、組織損傷和在病原體不存在或存在的創(chuàng)傷下激活。血清TLR4 主要的DAMPs 包括纖連蛋白、纖維蛋白原、熱休克蛋白70、氧化的低密度脂蛋白、透明質(zhì)酸片段等［16］。TLR4 上調(diào)受照射的骨髓細(xì)胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox2)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)的表達(dá)并促進(jìn)粒細(xì)胞生成。此外,血清TLR4 可防止骨髓微環(huán)境中脂肪組織的形成以及輻射引起的造血微環(huán)境的破 壞［17,18］。據(jù)研究,在體內(nèi)LPS 與血清TLR4 的相互作用可直接誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(HSC)增殖；然而長時(shí)間LPS 暴露會(huì)削弱HSC 的自我更新和再增殖活動(dòng)［19］。骨髓異常增生綜合征患者的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(HSPC)不僅會(huì)增加血清TLR4 的表達(dá),還會(huì)對(duì)TLR4 的配體更加敏感。分泌的內(nèi)源性DAMPs 與血清TLR4 和髓樣細(xì)胞受體髓系細(xì)胞分化抗原(CD33)結(jié)合,并通過HSPC上的直接和間接作用促進(jìn)骨髓增生異常綜合征(MDS)中的無效造血［20］。此外,刺激血清TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)可能對(duì)急性髓系白血病具有治療效果。血清TLR4 激動(dòng)劑可促進(jìn)髓母細(xì)胞的死亡和分化,直接促進(jìn)急性髓細(xì)胞性白血病(AML)的細(xì)胞死亡和分化［21］。

在臨床上HSPC 獲取困難,難以擴(kuò)大應(yīng)用。目前臨床上對(duì)于化療后骨髓抑制的診斷及檢驗(yàn)依舊采用外周血樣本。然而,雖然外周血細(xì)胞源于骨髓HSPC,但外周血細(xì)胞中各表達(dá)指標(biāo)是否參與化療所致骨髓抑制的發(fā)生機(jī)制正是本研究旨在探討解決的問題。本實(shí)驗(yàn)以外周血清為標(biāo)本,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定外周血中TLR4 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,化療后血清TLR4 水平與骨髓抑制程度呈正相關(guān)(r=0.540,P<0.05)?；熐昂笱錞LR4 水平的變化考慮為化療引起的組織損傷,釋放內(nèi)源性損傷因子,激活TLR4 的表達(dá),促進(jìn)先天免疫系統(tǒng)的促炎反應(yīng),通過下游反應(yīng)鏈引發(fā)炎癥反應(yīng)。骨髓抑制程度與血清TLR4 水平相關(guān),可能為骨髓組織中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)等細(xì)胞上的血清TLR4 激活,可促進(jìn)HSPC 分化,分化相關(guān)血液細(xì)胞后釋放入血,減輕患者骨髓抑制程度。

綜上所述,血清TLR4 水平與非小細(xì)胞肺癌化療后骨髓抑制存在相關(guān)性,TLR4 可能參與了化療后骨髓抑制的發(fā)生機(jī)制。但本研究樣本量較小,化療周期為 1 次,運(yùn)用的是外周血標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說明性有限,尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行前瞻性研究,明確TLR4 與化療骨髓毒性的具體機(jī)制,從而指導(dǎo)骨髓抑制的早期防治和優(yōu)化治療方案選擇。