microRNA let-7a-3調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中RAB11FIP2的表達(dá)

張利蘋(píng)，董文杰，李靜文，陳璐璐

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2020年全球結(jié)直癌發(fā)病人數(shù)為193.2萬(wàn)，占癌癥總發(fā)病人數(shù)的10.0%，居各癌種發(fā)病總?cè)藬?shù)第3位，分別是男性第三常見(jiàn)和女性第二常見(jiàn)惡性腫瘤[1-2]。目前CRC的治療手段主要有手術(shù)、化療、靶向治療及免疫治療等，但患者的預(yù)后仍較差，晚期CRC的生存率不足8%，因此有必要進(jìn)一步尋找CRC的潛在治療靶標(biāo)[3-4]。microRNA(miRNA)是高度保守的小非編碼RNA，約22個(gè)核苷酸，當(dāng)與靶mRNA的3’-UTR中存在互補(bǔ)序列時(shí)，可以通過(guò)抑制mRNA翻譯和促進(jìn)其降解等機(jī)制負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)[5]。let-7家族最早從線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)[6]，是最早發(fā)現(xiàn)的2個(gè)microRNA之一，既往研究顯示let-7在一些惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[7]。let-7a-3是let-7基因家族的成員，位于染色體12q13.31，與let-7a-1、let-7a-2共同編碼成熟的miRNA let-7a[8]。其啟動(dòng)子富含CpG二核苷酸重復(fù)序列，其表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化的表觀遺傳調(diào)控[9]。然而，目前尚不清楚CRC中是否也存在let-7a-3甲基化。本研究分析了90例CRC患者let-7a-3的DNA甲基化狀態(tài)、生物學(xué)功能及其可能的作用靶基因，并且評(píng)估了let-7a-3甲基化狀態(tài)與臨床特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例資料來(lái)源及細(xì)胞培養(yǎng)臨床資料購(gòu)買(mǎi)于上海芯超生物公司，包括90例CRC患者的性別、年齡、臨床分期、腫瘤部位等臨床信息及癌和匹配的相鄰非腫瘤組織樣本。使用的CRC細(xì)胞系有HCT116、SW480、HCT15、GEO、SW620，均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。在37 ℃、95%濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的條件下，用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%鏈霉素/青霉素抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 分離miRNA和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)使用Trizol試劑(Invitrogen)從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CRC細(xì)胞系中提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過(guò)ABI 7500 RT-PCR系統(tǒng)使用FastStart Universal SYBR Green Master評(píng)估let-7a-3和RAB11家族相互作用蛋白2(Rab11 family interacting protein 2，RAB11FIP2)的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。RAB11FIP2和let-7a-3的表達(dá)分別歸一化為GAPDH和U6。let-7a-3：上游5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTAAA-3’，下游5’-AACGAGACGACGACAGACTTT3’。RAB11FIP2：上游5’-AGTACTCACATGCCCGATGC-3’，下游5’-CTATGGTGCCAGCCTTCAGT-3’。GAPDH：上游5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游5’GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT3’。U6：上游5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，下游5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所用的pre-let-7a-3前體分子和陰性對(duì)照RNA寡核苷酸購(gòu)自Ambion公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CRC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種在不含抗生素的培養(yǎng)基中，在37 ℃、95%濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%時(shí)，根據(jù)操作手冊(cè)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)染。let-7a-3組和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染let-7a-3和陰性對(duì)照RNA寡核苷酸。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.4 聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析法和亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)CRC組織let-7a-3甲基化狀態(tài)通過(guò)聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制內(nèi)切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)和亞硫酸氫鹽測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)分析let-7a-3的甲基化狀態(tài)。使用EpiTect Bisulfite試劑盒(Qiagen)用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA(2 μg)。從亞硫酸氫鹽修飾的DNA中擴(kuò)增出包含胱抑素M啟動(dòng)子區(qū)15個(gè)CpG位點(diǎn)的片段。使用Methprimer軟件設(shè)計(jì)BSP的引物。使用的引物是5’-TTTGGTTGG TGGTTTTTTGTAGG-3’(正義)和 5’-TATATAATTATCCCATAACAAAAC-3’(反義)。將擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR產(chǎn)物克隆到 pMD18-T克隆載體(Takara)中。COBRA通過(guò)PCR產(chǎn)物在60 ℃下用識(shí)別序列為5’-CGCG-3’的限制性酶BstUI(New England BioLabs)消化12 h。將得到的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠染色。甲基化(M)與未甲基化(U)產(chǎn)物的比例(消化與未消化)通過(guò)密度計(jì)來(lái)測(cè)定，以確定甲基化的密度。甲基化百分比為M占M與U之和的百分?jǐn)?shù)。

1.5 去甲基化劑處理為探究let-7a-3表達(dá)與甲基化之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)組CRC細(xì)胞系用1 μmol·L-15-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC)處理，對(duì)照組不進(jìn)行5-aza-dC處理，各組細(xì)胞培養(yǎng)96 h，每日更換培養(yǎng)基。收集處理后的細(xì)胞行RT-PCR檢測(cè)let-7a-3表達(dá)，行COBRA實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)5-aza-dC對(duì)甲基化的作用。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CRC細(xì)胞凋亡利用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(annexin V-PI雙染色法)試劑盒(Biolegend)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集用let-7a-3或陰性對(duì)照RNA-寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的CRC細(xì)胞，置于1.5 mL EP管中，用PBS離心洗滌2次(1 500 r·min-1，5 min，4 ℃)，棄去上清。每管加入200 μL Binding Buffer和5 μL annexin V-FITC，室溫下孵育15 min。上機(jī)檢測(cè)前加入5 μL PI避光孵育5 min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的比率。

1.7 錨定-非依賴(lài)性生長(zhǎng)錨定-非依賴(lài)性生長(zhǎng)試驗(yàn)即軟瓊脂試驗(yàn)，檢測(cè)let-7a-3對(duì)CRC細(xì)胞集落形成能力的影響。建立轉(zhuǎn)染let-7a-3和陰性對(duì)照的CRC細(xì)胞，24 h后用DMEM重懸細(xì)胞，取1×104個(gè)細(xì)胞置于3 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂/生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在鋪有6 g·L-1瓊脂墊的6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3周后，對(duì)直徑>1 mm的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)let-7a-3與RAB11FIP2靶標(biāo)關(guān)系通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增包含預(yù)測(cè)的let-7a-3結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)RAB11FIP23’UTR片段。使用Stratagene Quik-Change定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)對(duì)let-7a-3靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。對(duì)該構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序并命名為RAB-UTR-Mut。用pMIR-report熒光素酶載體構(gòu)建RAB-UTR或RAB-UTR-Mut質(zhì)粒(Ambion)。細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔中以標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率共轉(zhuǎn)染10 ng phRL-TK海腎熒光素酶載體(Promega)。500 ng RAB-UTR或RAB-UTR-Mut質(zhì)粒連同10 nmol·L-1pre-let-7a-3或陰性對(duì)照也被共轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000和Opti-MEM Ⅰ血清培養(yǎng)基(Life Technologies)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。歸一化相對(duì)熒光素酶活性為螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎螢光素酶之比。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中l(wèi)et-7a-3的甲基化分析及與臨床特征之間的關(guān)系let-7a-3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周?chē)缭?5個(gè)CpG位點(diǎn)的CpG富含區(qū)和BstUI識(shí)別序列如圖1A所示。利用COBRA對(duì)CRC組織中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，let-7a-3基因的啟動(dòng)子甲基化在90個(gè)癌組織樣本中有71個(gè)(78.89%)呈陽(yáng)性，而90個(gè)配對(duì)的相鄰癌旁組織樣本中有17(18.89%)個(gè)為陽(yáng)性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。部分代表性樣本的甲基化COBRA凝膠分析如圖1B所示，條帶上方數(shù)字代表樣本編號(hào)。CRC組織let-7a-3甲基化頻率與組織來(lái)源即癌或癌旁組織有關(guān)(P<0.001)，與性別(P=0.283)、年齡(P=0.945)、臨床分期(P=0.167)和腫瘤部位(P=0.161)無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 let-7a-3甲基化狀態(tài)與臨床特征之間的關(guān)系

A為與let-7a-3的啟動(dòng)子相關(guān)的CpG島圖，用于亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR的正義和反義引物的位置用下劃線表示；B為CRC組織中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子甲基化的代表性COBRA結(jié)果，來(lái)自亞硫酸氫鹽處理的DNA的PCR產(chǎn)物用BstUI消化，在完全或部分消化時(shí)產(chǎn)生消化條帶，消化的片段對(duì)應(yīng)于甲基化的DNA，條帶頂部數(shù)字代表樣本編號(hào)。

2.2 去甲基化劑5-aza-dC誘導(dǎo)let-7a-3表達(dá)BSP顯示CRC細(xì)胞具有廣泛的let-7a-3基因啟動(dòng)子甲基化。見(jiàn)圖2A。RT-PCR結(jié)果顯示，用去甲基化劑5-aza-dC處理后CRC細(xì)胞let-7a-3的表達(dá)被誘導(dǎo)。見(jiàn)圖2B。COBRA結(jié)果證實(shí)用5-aza-dC處理CRC細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致部分去甲基化。見(jiàn)圖2C。

A為CRC細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子的單個(gè)亞硫酸氫鹽測(cè)序克隆的甲基化模式，黑色和白色區(qū)域分別代表每個(gè)病例測(cè)序的菌落中甲基化和未甲基化CpG位點(diǎn)的百分?jǐn)?shù)；B為通過(guò) RT-PCR測(cè)定用或不用去甲基化劑5-aza-dC處理的CRC細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3的表達(dá)，*P<0.001；C為COBRA檢測(cè)證實(shí)5-aza-dC的去甲基化功能。

2.3 外源性表達(dá)let-7a-3誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致CRC細(xì)胞錨定-非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力減弱對(duì)CRC細(xì)胞系進(jìn)行l(wèi)et-7a-3或陰性對(duì)照RNA-寡核苷酸轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照相比，用let-7a-3處理的細(xì)胞凋亡水平更高(P<0.001)。見(jiàn)圖3A。使用HCT116細(xì)胞系進(jìn)行錨定-非依賴(lài)性生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，let-7a-3的外源表達(dá)抑制CRC細(xì)胞的不依賴(lài)貼壁能力(P<0.001)。見(jiàn)圖3B、C。

A為通過(guò)流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染let-7a-3前體分子或陰性對(duì)照的細(xì)胞的凋亡百分?jǐn)?shù)，每個(gè)條形上方的值代表膜聯(lián)蛋白V+/PI-和膜聯(lián)蛋白V+/PI+的分?jǐn)?shù)，*P<0.001；B、C為3周后的菌落測(cè)定示例，放大倍數(shù)×400，細(xì)胞用吉姆薩染色；圖中數(shù)值為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.4RAB11FIP2是let-7a-3的作用靶基因使用3種miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)算法，即miRanda、PicTar和TargetScan對(duì)CRC中l(wèi)et-7a-3的潛在基因靶標(biāo)進(jìn)行計(jì)算分析，最后選擇RAB11FIP2作為候選靶基因。為研究let-7a-3是否直接識(shí)別RAB11FIP2mRNA的3’UTR，將帶有預(yù)測(cè)的let-7a-3靶位點(diǎn)的序列或帶有預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的突變序列克隆到pMIR熒光素酶報(bào)告基因下游。當(dāng)用let-7a-3轉(zhuǎn)染野生型或突變型載體時(shí)，與突變型載體相比，野生型載體的熒光素酶活性降低(P<0.001)。見(jiàn)圖4A。當(dāng)野生型或突變型載體轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA時(shí)，野生型或突變型載體之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明let-7a-3可能在RAB11FIP2的調(diào)節(jié)中起作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RAB11FIP2是let-7a-3的作用靶點(diǎn)，對(duì)用let-7a-3模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染let-7a-3后RAB11FIP2表達(dá)降低。見(jiàn)圖4B。

A為與RAB-UTR-Mut和對(duì)照組相比，RAB-UTR載體中的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因活性降低(*P<0.001)；B為用let-7a-3前體分子或陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染后CRC細(xì)胞中RAB11FIP2的相對(duì)表達(dá)水平。

3 討論

CRC的發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括一系列遺傳、組織學(xué)和形態(tài)學(xué)改變。近年來(lái)年輕人群CRC發(fā)病率增加，這與多種因素相關(guān)，如不良生活方式、肥胖、腸道炎癥、癌癥史、CRC家族史等[10-11]。高達(dá)30%的CRC患者存在轉(zhuǎn)移CRC，需要進(jìn)行全身治療[12]。靶向治療已經(jīng)成為CRC患者全身治療的重要手段，如靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的貝伐珠單抗、靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的西妥昔單抗等靶向藥物已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，并且顯著改善患者的預(yù)后。因此，有必要對(duì)CRC的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究，以期探索新的基因靶點(diǎn)。

miRNA及其靶mRNA在癌癥中差異表達(dá)，一些miRNA可作為癌基因或腫瘤抑制因子。既往研究顯示miRNA在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、代謝和發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[13]。let-7a-3是miRNA家族的成員，相關(guān)研究顯示let-7a-3低甲基化與疾病不良預(yù)后相關(guān)。例如在肺腺癌中l(wèi)et-7a-3低甲基化促進(jìn)了基因的表觀遺傳再激活[9,14]。慢性髓系白血病中l(wèi)et-7a-3低甲基化與疾病進(jìn)展相關(guān)[15]，同樣地，let-7a-3低甲基化預(yù)示急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者預(yù)后不良[16-17]。而在某些疾病中l(wèi)et-7a-3高甲基化，如在乳腺癌中l(wèi)et-7a-3廣泛甲基化[18]。同時(shí)，let-7a-3的啟動(dòng)子高甲基化可能通過(guò)靶向UHRF1/DNMT1參與糖尿病腎病的發(fā)展[19]。上述研究結(jié)果表明不同疾病中l(wèi)et-7a-3甲基化水平具有差異性，對(duì)疾病的調(diào)控作用也不同，其作用可能具有組織特異性或腫瘤特異性。

目前，CRC中l(wèi)et-7a-3的甲基化狀態(tài)尚不清楚，本研究分析了90例CRC患者let-7a-3的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示90例癌組織樣本有71例(78.89%)樣本let-7a-3甲基化呈陽(yáng)性，而配對(duì)癌旁組織樣本陽(yáng)性率僅為18.89%，表明let-7a-3啟動(dòng)子甲基化在CRC組織中是一種常見(jiàn)情況。這與上皮性卵巢癌中也可以檢測(cè)到let-7a-3高甲基化類(lèi)似，在卵巢癌中l(wèi)et-7a-3的高甲基化與胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ的低表達(dá)和患者的良好預(yù)后有關(guān)[20]。用去甲基化劑5-aza-2-dC處理CRC細(xì)胞后let-7a-3表達(dá)上調(diào)，COBRA證實(shí)用5-aza-dC處理會(huì)導(dǎo)致CRC部分去甲基化，上述結(jié)果共同表明去甲基化可以誘導(dǎo)let-7a-3的表達(dá)。細(xì)胞凋亡和錨定-非依賴(lài)性生長(zhǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)let-7a-3過(guò)表達(dá)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制體外貼壁非依賴(lài)性生長(zhǎng)。對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)let-7a-3的高甲基化與組織來(lái)源有相關(guān)性，但與性別、年齡及臨床分期等因素?zé)o關(guān)。let-7a-3在CRC中的作用機(jī)制尚不清楚，本研究利用miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)程序選擇RAB11FIP2為候選靶基因，先前研究表明RAB11FIP2參與質(zhì)膜蛋白的內(nèi)體運(yùn)輸，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，在CRC中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲[21-22]。使用克隆到熒光素酶基因下游的RAB11FIP2的3’-UTR的報(bào)告基因分析顯示在let-7a-3存在時(shí)熒光素酶活性降低，說(shuō)明let-7a-3可能是RAB11FIP2的直接調(diào)節(jié)因子。在轉(zhuǎn)染let-7a-3后，CRC細(xì)胞中RAB11FIP2表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了let-7a-3對(duì)RAB11FIP2具有調(diào)控作用。綜上可以推理在CRC中l(wèi)et-7a-3的表觀遺傳沉默可能使RAB11FIP2上調(diào)從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究的局限性在于未從臨床樣本中檢測(cè)RAB11FIP2蛋白水平，未研究let-7a-3甲基化與患者臨床預(yù)后的關(guān)系，未來(lái)可進(jìn)行相關(guān)研究。

總之，在結(jié)直腸癌中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子甲基化是一個(gè)常見(jiàn)事件，去甲基化可誘導(dǎo)let-7a-3表達(dá)。let-7a-3表達(dá)上調(diào)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)。let-7a-3通過(guò)靶向RAB11FIP2基因在CRC的發(fā)生中起一定作用，提示let-7a-3可能是CRC治療的潛在生物標(biāo)志物。