siRNA靶向下調(diào)RhoA基因?qū)β愿哐蹓盒∈笠暪δ艿谋Ｗo(hù)作用

劉茜，劉長庚，李海軍，董仰曾，張穎

(河南省人民醫(yī)院/河南省立眼科醫(yī)院/河南省眼科研究所/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 眼科，河南 鄭州 450000)

青光眼是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)及其在視神經(jīng)內(nèi)的軸突丟失造成的眼部疾病，是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，也是全球不可逆盲的主要原因之一[1-3]。眼壓升高是導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突丟失的主要危險(xiǎn)因素，視神經(jīng)保護(hù)及其治療靶點(diǎn)的干預(yù)治療是青光眼防盲治盲的關(guān)鍵[4-5]。Rho是與Ras相關(guān)的小分子鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTPase)超家族Rho家族的成員，Rho有3種異構(gòu)體類型：RhoA、RhoB和RhoC[6]。Rho通路的激活會(huì)導(dǎo)致小梁網(wǎng)(trabecular meshwork，TM)收縮，并且該通路的抑制將引起TM的松弛，隨后增加流出量，從而降低眼內(nèi)壓(intraocular pressure，IOP)[7]。其中，RhoA存在于培養(yǎng)的TM細(xì)胞，并且RhoA信號通路廣泛參與人體多種生理和疾病病理以及視神經(jīng)保護(hù)過程[8]。研究表明，Y-27632能夠特異性抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated kinase，ROCK)及其下游的肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)，改變?nèi)搜跿M細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)和細(xì)胞黏附力，降低應(yīng)力纖維的收縮，促進(jìn)房水的外引流，降低眼壓[9]。因此，確定靶向TM細(xì)胞的機(jī)制可能有助于開發(fā)治療青光眼的有效策略。本研究擬玻璃體腔注射RhoA siRNA(siRhoA)，探討RNA干擾技術(shù)治療青光眼的可行性，為深入研究siRhoA青光眼視神經(jīng)保護(hù)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料C57小鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督監(jiān)測站提供，為無特定病原體動(dòng)物，飼養(yǎng)于室溫24 ℃的環(huán)境中，維持明/暗12 h循環(huán)交替光照條件。靶向RhoA的小干擾RNA片段(siRhoA)和siRNA陰性對照片段由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，其中正義鏈F：5’-GAAGUCAAGCAUUUCUGUCdTdT-3’，反義鏈R：3’-dTdTCUUCAGUUCGUAAAGACAG-5’。CCK-8試劑盒購自廈門侖昌碩生物科技有限公司，地塞米松(dexamethasone，DEX)購自西安康諾化工有限公司，RhoA抗體購自Abcam公司。采用APS-2000AER視覺電生理檢查儀(德國蔡司)對受試者閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，f-VEP)進(jìn)行分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用遵守“眼與視覺研究協(xié)會(huì)動(dòng)物使用聲明”相關(guān)規(guī)定，經(jīng)河南省立眼科醫(yī)院中心倫理審查委員會(huì)通過(HNEECA-2021-11)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型擬采用既往實(shí)驗(yàn)建立的方法[10]。選取21只4～6周的C57小鼠(雌雄各半)，隨機(jī)分為3組(A組，B組，C組)。3組小鼠以1 g·L-1DEX持續(xù)低濃度點(diǎn)左眼(處理眼，DEX)，右眼接受生理鹽水持續(xù)點(diǎn)眼(對照眼，NS)。使用Tonopen眼壓計(jì)測量小鼠眼壓。采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot檢測第 28天DEX處理眼和對照眼中RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量。

1.2.2玻璃體腔注射 體內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA的配制采用既往實(shí)驗(yàn)建立的方法[11]。第28天時(shí)，小鼠左眼行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。以40 g·L-1水合氯醛麻醉動(dòng)物，鹽酸丁卡因進(jìn)行局部麻醉，體視顯微鏡下，經(jīng)角鞏膜緣前約0.5 mm進(jìn)行前房穿刺，放出少量房水，用25 G的微量注射器將5 μL siRNA距離角鞏膜緣1 mm處行玻璃體腔注射。其中A組(實(shí)驗(yàn)組)注射siRhoA，B組(陰性對照組)注射陰性對照siRNA(NC siRNA)，C組(對照組)注射PBS緩沖液，術(shù)后于1、4、7、14、28 d測量小鼠術(shù)眼眼壓。

1.2.3視覺電生理檢查 注射后28 d對各實(shí)驗(yàn)組視覺功能進(jìn)行f-VEP檢測[12]，將小鼠麻醉后固定于固定架上，在暗室內(nèi)使用EP1000 Pro型眼電生理檢查儀(日本Tomey公司)，于小鼠頭部后方相對應(yīng)眼的螺旋釘上接作用電極，前部螺旋釘上接參考電極，接地電極不銹鋼針插入小鼠尾部上方。小鼠眼睛距離閃光刺激源10 cm，共測量3次，每次間隔5 min，取測量平均值，比較視網(wǎng)膜功能恢復(fù)情況。

1.2.4體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率檢測 siRhoA注射后，于第28天利用qRT-PCR檢測視網(wǎng)膜組織RhoA基因變化情況(其中正義鏈F：5’-CCCGTTCTATACCGGGTGAA-3’，反義鏈R：3’-CAAAAGTTTGTGGCACCCGT-5’，以β-actin基因作為管家基因，各基因的相對表達(dá)量參照2-△△Ct方法)，使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。采用Western blot檢測RhoA蛋白表達(dá)情況：使用勻漿器提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白變性處理10 min后，行凝膠電泳，蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用40 g·L-1的脫脂牛奶于室溫條件下封閉1 h，再經(jīng)一、二抗孵育后加入顯色劑曝光，于冷CCD凝膠成像系統(tǒng)中拍攝掃描圖片，用Image J-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 DEX誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼壓及RhoA表達(dá)量變化處理前小鼠基線眼壓為(10.26±1.52)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。生理鹽水處理眼與對照眼眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.209，P=0.928)。1 g·L-1DEX持續(xù)點(diǎn)眼可引起持續(xù)眼壓升高，眼壓在第1天即出現(xiàn)較高水平，持續(xù)至第28天(F=71.752，P<0.001)(圖1A)。DEX處理眼與對照眼眼壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=43.872，P時(shí)間<0.001；F組間=263.333，P組間<0.001；F交互=38.228，P交互<0.001)(圖1A)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，DEX處理28 d后左眼視網(wǎng)膜組織RhoA基因(F=67.434，P=0.001)和RhoA蛋白(F=150.482，P<0.001)的表達(dá)量與對照眼相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B、C、D)。

A為0～28 d小鼠眼壓變化情況；B為qRT-PCR檢測小鼠視網(wǎng)膜組織RhoA基因表達(dá)量變化情況；C、D為Western blot檢測小鼠視網(wǎng)膜組織RhoA蛋白表達(dá)量變化；DEX代表地塞米松處理眼，NS代表生理鹽水處理眼；**P<0.01。

2.2 siRNA注射后眼壓變化情況注射siRhoA后，A組小鼠的眼壓在初期(1、4、7 d)略有下降，但與對照眼相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與B組和C組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組眼壓變化情況

2.3 siRNA注射后RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量變化注射siRNA和PBS后第28天，檢測各組小鼠雙眼視網(wǎng)膜組織中RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，A組小鼠左眼中RhoA基因(F=0.004，P=0.995)和RhoA蛋白表達(dá)量(F=0.004，P=0.995)相較對照眼差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組小鼠左眼中RhoA基因(F=47.336，P=0.002)和RhoA蛋白表達(dá)量(F=37.701，P=0.004)相較對照眼有較高的表達(dá)，C組小鼠左眼中RhoA基因(F=70.141，P=0.001)和RhoA蛋白表達(dá)量(F=70.141，P=0.001)也比對照眼表達(dá)高(圖2)。

A為qRT-PCR檢測高眼壓模型小鼠玻璃體腔注射后RhoA基因表達(dá)量相較對照眼的變化；B和C為Western blot檢測高眼壓模型玻璃體腔注射治療后RhoA蛋白表達(dá)量相較對照眼的變化；DEX代表地塞米松處理眼，NS代表生理鹽水處理眼；**P<0.01。

2.4 各組小鼠的視覺功能變化玻璃體腔注射后，A組小鼠左眼f-VEP 的N波潛伏期、P波潛伏期和P波振幅逐漸恢復(fù)，相較B組和C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B組和C組小鼠左眼f-VEP的P波和N波潛伏期延長，P波振幅降低(P<0.05)。見表2。

表2 注射后第28天與對照眼f-VEP情況的比較

3 討論

青光眼是一類影響人類和動(dòng)物的復(fù)雜視神經(jīng)病變。眼壓的調(diào)節(jié)對視功能至關(guān)重要，其升高仍然是青光眼發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素[13-14]。由于TM在維持正常房水流出和調(diào)節(jié)IOP中起關(guān)鍵作用，所以干預(yù)TM組織可能是降低IOP的重要臨床治療方式[15]。在以前的研究中，DEX顯示出誘導(dǎo)TM細(xì)胞中RhoA的瞬時(shí)激活[7,16]，進(jìn)一步激活了下游效應(yīng)器ROCK。研究表明，RhoA/ROCK在調(diào)節(jié)IOP中起重要作用，RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶和ROCK抑制劑Y-27632能夠特異性抑制ROCK激酶及其下游的肌球蛋白輕鏈磷酸酶，改變?nèi)搜坌×杭?xì)胞的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)和細(xì)胞黏附力，降低應(yīng)力纖維的收縮，促進(jìn)房水的外引流[17-18]?；谶@些，證明了DEX不僅增加了RhoA的表達(dá)，而且激活了ROCK，DEX可能通過RhoA/ROCK途徑誘導(dǎo)，升高眼壓，進(jìn)一步表明RhoA可能作為降低眼內(nèi)壓的干預(yù)因子[19-20]。

本研究通過DEX誘導(dǎo)慢性高眼壓小鼠模型，經(jīng)qRT-PCR和Western blot檢測RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示所有小鼠DEX誘導(dǎo)后眼壓升高(7、14、21、28 d)，初步構(gòu)建慢性高眼壓動(dòng)物模型，DEX誘導(dǎo)眼視網(wǎng)膜組織與生理鹽水處理后對照眼的RhoA基因和RhoA蛋白的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王艷華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在眼部急性高眼壓大鼠模型實(shí)驗(yàn)損傷后的視網(wǎng)膜中，RhoA蛋白表達(dá)高于正常大鼠視網(wǎng)膜組織，隨損傷時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量上升；此外，在去核豬眼中RhoA介導(dǎo)的TM收縮導(dǎo)致眼壓快速升高[22]。其他研究表明，在前房注射轉(zhuǎn)化生長因子-β1后的前3 d內(nèi)，RhoA的mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)也觀察到眼壓的早期升高[23]。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了RhoA與青光眼之間的關(guān)系。

此外，通過siRhoA玻璃體腔注射治療后，注射siRhoA組小鼠的RhoA基因表達(dá)量和RhoA蛋白表達(dá)量下調(diào)，且均低于NC siRNA和PBS組表達(dá)量；本研究結(jié)果顯示，siRhoA玻璃體腔注射降低DEX誘導(dǎo)后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量。與對照組相比，siRhoA更及時(shí)有效地預(yù)防了眼壓升高，表明正常小鼠和DEX處理小鼠之間IOP變化的差異可能是由于DEX誘導(dǎo)的TM功能障礙[7]。此外，本研究通過f-VEP檢測玻璃體腔注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視覺功能的情況。已有研究證實(shí)f-VEP可用于動(dòng)物視神經(jīng)傳導(dǎo)功能的監(jiān)護(hù)，是客觀、可靠地評價(jià)視功能的一種方法[12,24]。f-VEP是視網(wǎng)膜受到閃爍光刺激后，在枕葉視皮層產(chǎn)生的電活動(dòng)，枕皮層首先直接反映了視皮層的活動(dòng)以及視皮層和其的聯(lián)系；其次，間接反映了從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始，以及從節(jié)細(xì)胞到中樞的視信息處理系統(tǒng)，尤其是中心視功能系統(tǒng)的狀態(tài)[25]。本研究中A、B、C組小鼠左眼的f-VEP中P波潛伏期和P波振幅與對照眼相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明慢性高眼壓小鼠模型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失較多導(dǎo)致光敏度降低，從而導(dǎo)致P波幅降低、潛伏期延長視力水平低于對照眼。經(jīng)siRhoA治療后，A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物N波、P波潛伏期和P波振幅逐漸恢復(fù)，雖未完全至正常水平，但相較B和C組而言，f-VEP異常減輕，表明其神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失可能得到改善，視覺通路神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)速度加快，異常組織結(jié)構(gòu)與功能趨于恢復(fù)。本研究表明，利用siRhoA方法治療與TM相關(guān)的疾病是可行的，如青光眼。

本研究通過玻璃體腔注射干擾siRhoA表達(dá)，相較NC siRNA和PBS組RhoA基因和RhoA蛋白表達(dá)量降低。同時(shí)，相較陰性對照組，siRhoA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的視覺功能恢復(fù)。本研究為青光眼基因治療的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。