蒲地金黃貼質量標準的研究

安俏顏 陳震堯▲ 鄧禮荷 夏靜文 劉 燕

1.廣東省肇慶市中醫(yī)院藥劑科，廣東肇慶 526020；2.肇慶醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，廣東肇慶 526020

蒲地金黃貼處方由黃柏、大黃、黃芩、梔子、側柏葉、蒲公英、廣地丁、紫蘇葉8種藥味組成，該制劑是根據(jù)肇慶市中醫(yī)院（我院）臨床經驗方，通過制備工藝研究，全藥粉與基質混合制成的貼膏劑，具有散瘀消腫、清熱解毒的作用，適應證為跌打腫痛、熱毒內蘊而見局部紅腫熱痛。

蒲地金黃貼作為研發(fā)的中藥新制劑，其化學成分復雜、性質各不相同，尚未建立全面的質量內控指標，為有效控制該制劑的質量，對蒲地金黃貼的質量標準進行方法學研究[1]。選用薄層色譜法對蒲地金黃貼中黃芩、梔子開展定性鑒別；對大黃、黃柏、側柏葉選用顯微鑒別方法；鹽酸小檗堿作為君藥黃柏成分中的主要有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、免疫調節(jié)、降血糖和血壓等多種作用，高效液相色譜法具備分離速度快、選擇性好、檢測的靈敏度高等優(yōu)點，因此選取該法測定鹽酸小檗堿的含量[2-4]，以建立我院制劑室開發(fā)的醫(yī)院制劑蒲地金黃貼的質量標準，為貼膏劑質量控制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

臺式數(shù)控超聲波清洗器（型號：KQ5200DE，頻率：40 kHz，功率：200 W）；高效液相色譜儀（型號：Agilent 1260，美國Agilent公司）；真空泵（型號：AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電子天平（型號：CPA225D，德國賽多利斯公司）；奧林巴斯CX31生物顯微鏡；多功能紫外分析儀（型號：ZF1-I，上海和勤分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

供 試 品 蒲 地 金 黃 貼（批 號：2021060901、2021060902、2021060903，由我院自制）、缺黃柏陰性樣品、缺黃芩陰性樣品、缺梔子陰性樣品（我院制劑室自制）；試驗用對照品（于中國食品藥品檢定研究院購入）：梔子苷（110749-201919）、鹽酸小檗堿（110713-200911）、黃芩苷（110715-201815）；水為純化水，薄層層析硅膠板（10 cm×20 cm）；乙腈為色譜純，甲醇、正丁醇等試劑均為分析純。

2 顯微鑒別

取蒲地金黃貼適量，涂片，置顯微鏡下觀察：石細胞顏色呈鮮黃色，層紋明顯，壁厚，分枝狀，纖維束鮮黃色，周圍細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（黃柏），草酸鈣簇晶（大黃）大，直徑60～140 mm；氣孔可見，黃綠色，凹陷型，保衛(wèi)細胞較大，側面觀呈啞鈴狀（側柏葉）[5-7]，見圖1。

圖1 蒲地金黃貼顯微特征圖

3 薄層色譜鑒別

3.1 黃芩薄層色譜鑒別

取供試品蒲地金黃貼1貼，除去背襯和蓋襯，稱取10 g，加水60 ml，搖勻，超聲處理30 min，離心，取上清液，濾過，濾液蒸至約30 ml，放冷，石油醚（每次30 ml）洗滌2次，棄去石油醚液，用鹽酸調pH至2，每次用乙酸乙酯30 ml提取，共2次[8]，將提取所得的乙酸乙酯液合并后蒸干，加入1 ml甲醇液溶解殘渣，所得液作為供試品溶液。按照上述同樣的方法制備相同處方比例缺黃芩的陰性對照溶液[9]。另稱取黃芩苷對照品，加適量甲醇制成每1 ml含5 mg黃芩苷對照品的溶液。依照薄層色譜法進行試驗，吸取上述三種溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，點樣量為各3 μl，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶3∶2）的上層溶液為展開劑，展開高度為9 cm，取出，晾干后取3%三氯化鐵乙醇溶液適量噴在薄層板上。結果顯示，供試品在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖2A。

3.2 梔子薄層色譜鑒別

取本品1貼，除去背襯和蓋襯，稱取10 g，加50%甲醇溶液60 ml溶解，離心，取上清液過濾并蒸干，加水30 ml溶解殘渣，每次用石油醚30 ml洗滌，共2次，將石油醚液棄去，所得溶液用水飽和的正丁醇30 ml依次提取2次，將正丁醇液合并后蒸干，加入2 ml甲醇液溶解殘渣，作為供試品溶液。按照上述同樣的方法制備相同處方比例缺梔子的陰性對照溶液。另取適量甲醇加入稱量好的梔子苷對照品，制成每1 ml含5 mg梔子苷對照品的溶液。依照薄層色譜法進行試驗，吸取上述對照品溶液2 μl、供試品溶液3 μl、陰性對照溶液3 μl、分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）為展開劑，展開高度為8 cm，取出后晾干，取適量10%硫酸乙醇溶液噴在薄層板上，隨后加熱至斑點顯色清晰，結果顯示，供試品在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾[10-12]。見圖2B。

圖2 蒲地金黃貼薄層色譜圖

4 含量測定

4.1 色譜條件

色 譜 柱（型 號：Agilent ZORBAX-SB-C18），進樣量5 μl，檢測波長：265 nm，0.1%磷酸溶液-乙腈體積比例為50∶50為流動相（每100 ml溶液加十二烷基磺酸鈉0.1 g），柱溫：30℃。

4.2 供試品溶液的制備

精密稱定本品約7.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合溶液鹽酸-甲醇（1∶100）50 ml，稱定其重量，進行時長為30 min的超聲，待冷卻后再次稱定重量，取用混合溶液鹽酸-甲醇（1∶100）適量補足減失的重量，取2 ml移至5 ml干凈的容量瓶后用流動相定容至刻度即可，過濾用微孔濾膜（孔徑：0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

4.3 對照品溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定后加入甲醇溶解制成貯備液（每l ml含0.25 mg）。于10 ml干凈量瓶中加入精密量取的1 ml貯備液，并加入流動相定容至刻度，搖勻，過濾用微孔濾膜（孔徑：0.45 μm），即得對照品溶液（每l ml含25 μg）。

4.4 陰性對照樣品溶液的制備

依照本品的制備工藝和處方配比制成缺黃柏的陰性樣品，再依照上述4.2項下供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液[13]。

4.5 專屬性試驗

分別依次精密吸取陰性對照樣品溶液、對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進行測定，吸取量均為5 μl，結果顯示陰性對照在相同位置無色譜峰，對測定無干擾，對照品對比供試品，在相同位置有色譜峰，鹽酸小檗堿與其他成分的色譜峰分離度＞1.5[14-16]。對照品、供試品、陰性對照圖譜分別見圖3。

圖3 高效液相色譜法色譜圖

4.6 線性范圍考察

吸取對照品溶液12.5、25.0、50.0、125.0、250.0、375.0、500.0 ng，按照4.1項下的色譜條件進行注入樣品測定，取不同的進樣量作為橫坐標，取進樣量的峰面積作為縱坐標，進行線性回歸分析，結果鹽酸小檗堿進樣量在12.5～498.4 ng內，線性關系考察為良好[17]，回歸方程為：Y=118.33X-6.44，r=1.0000。

4.7 儀器精密度試驗

吸取對照品溶液，連續(xù)進樣6次測定，每次的量均為5 μl，鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.63%，結果顯示含量測定的儀器精密度為良好。

4.8 重復性試驗

取供試品（批號：2021060901）6份，精密稱定每份約7.0 g，依照4.2項下方法制得樣品批次為2021060901的6份供試品溶液，依次進樣測定，得出供試品中鹽酸小檗堿的平均含量為4066 μg（n=6），RSD為0.52%，結果表明，該供試品溶液的制備方法重復性良好。

4.9 穩(wěn)定性試驗

同一供試品溶液（批號：2021060901）經精密吸取，分別在0、2、4、6、8、12 h各進樣一次測定。測得12 h內鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.63%，表明在12 h內，供試品溶液穩(wěn)定性呈現(xiàn)的結果為良好。

4.10 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品（批號：2021060901）9份，精密稱定，各約3.5 g，分為3組，每組3份，精密量取對照品1、2、3 mg分別加至每組樣品中[18]，依照4.2項下方法制得9份供試品溶液，每份依次進樣測定，每次5 μl，計算回收率，結果鹽酸小檗堿回收率平均值為99.7%（n=9），RSD為1.69%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=9）

4.11 樣品含量測定

取3批次的蒲地金黃貼（批號：2021060901、2021060902、2021060903），供試品溶液依照4.2項下制備方法所得，每批供試品溶液依次進樣測定，平行測3份，取平均值，根據(jù)外標法計算鹽酸小檗堿含量，結果顯示蒲地金黃貼平均每克中含量為565.18 μg，RSD為0.65%。按其含量下浮幅度20%計，則蒲地金黃貼每克含鹽酸小檗堿含量限度可暫定為應不低于452.14 μg。

5 討論

5.1 薄層鑒別的選擇

本研究在薄層鑒別藥味的選擇上進行了預實驗，分別按照《中國藥典》[19]蒲公英、紫蘇葉項下收載薄層鑒別方法試驗，對照藥材與供試品色譜在相對應的位置上并沒有出現(xiàn)相同顏色的斑點。同時，在《中國藥典》[19]以及相關的文獻資料中，未找到有關廣地丁的薄層色譜鑒別研究方法。

前期在對黃芩薄層色譜預實驗研究中，曾選用展開劑甲苯-甲醇-乙酸乙酯-甲酸（10∶1∶3∶2）進行試驗，顯色劑為適量的3%三氯化鐵乙醇溶液，雖然陰性對照無干擾，對照品與供試品色譜在相應位置上顯相同顏色的斑點，但Rf值過低，分離度差。后調整顯色劑和展開劑的組分，改為乙酸丁酯-水-甲酸（7∶2∶3），3%三氯化鐵溶液作為顯色劑，結果對照品與供試品在色譜上對應良好，且斑點清晰，分離度高，預飽和30 min效果更好。

5.2 流動相的選擇

本研究考察了兩種比例的流動相，前者為0.1%磷酸溶液-乙腈（55∶45），每100 ml溶液中加入十二烷基磺酸鈉0.1 g，后者為0.1%磷酸溶液-乙腈（50∶50），每100 ml溶液加十二烷基磺酸鈉0.1 g，結果表明后者比例流動相的分離度高、峰形更好。

5.3 提取方法的選擇

本研究考察了兩種提取方法，分別是供試品加入鹽酸-甲醇（1∶100）的混合溶液后加熱回流1 h和超聲30 min，按照測定的含量顯示，加熱回流與超聲處理測出的含量差別不大，但超聲處理省時和操作簡便，更適合作為本品的提取方法。

蒲地金黃貼處方由八味藥材組成，方中君藥為大黃、黃柏，其中黃柏具有通絡、清熱等功能；大黃則有涼血逐瘀的作用。黃芩、梔子、側柏葉為臣藥，其中黃芩外用可治療癰腫瘡癤等外科疾患；梔子外用于跌打損傷導致的腫痛；側柏葉既可療治筋骨折傷，又可破除瘀血癥瘕。蒲公英、廣地丁合為佐藥。在蒲地金黃貼的質量標準研究中，采用顯微鑒別法和高效液相色譜法測定方中君藥黃柏，選用顯微鑒別法鑒定方中君藥大黃和臣藥側柏葉，采用薄層色譜法鑒別方中臣藥黃芩和梔子。

綜上所述，本研究采用顯微鑒別法鑒定出大黃、黃柏、側柏葉，薄層色譜法對蒲地金黃貼中黃芩、梔子進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定蒲地金黃貼中的鹽酸小檗堿含量，建立了蒲地金黃貼的質量標準。

通過查閱相關文獻的研究結果進行分析比較[20-21]，有研究應用薄層色譜對黃芩、梔子、大黃、黃柏進行定性檢測，有研究選用高效液相色譜法對黃芩苷、梔子苷、鹽酸小檗堿等進行定量測定，也有研究實行單一藥味多種檢測方法的質控模式。由于每種中藥制劑的組方與比例各不相同，且化學成分復雜，因此質量標準研究中要求陰性無干擾。本方法重復性好、無陰性干擾、準確簡便、專屬性強。

蒲地金黃貼作為中藥制劑，成分復雜，增加質量內控指標能使制劑的質量更穩(wěn)定、安全、有效。本研究選取高效液相色譜法測定黃柏中鹽酸小檗堿的含量，測定成分單一，具有一定的局限性。黃柏作為本方的君藥，除了鹽酸小檗堿還有4種成分。一測多評法具有成本低、實用性強的優(yōu)點，可嘗試采用一測多評法的質控模式對五種生物堿進行含量測定，更全面地控制蒲地金黃貼質量。