HPLC法測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量

盧向紅 劉利輝 汪 霞 佘林立

1.湖南省婁底市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，湖南 婁底 417100；2.岳陽(yáng)新華達(dá)制藥有限公司，湖南 岳陽(yáng) 414000

苦柏洗劑是由岳陽(yáng)市第二人民醫(yī)院制劑室委托岳陽(yáng)新華達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)的中藥制劑，其處方組成為苦參、鴉膽子、黃柏、丁香、蛇床子、海馬、白鮮皮、薄荷素油和艾葉。具有清熱解毒，燥濕殺蟲，祛風(fēng)止癢的功效，臨床主要用于真菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、老年性陰道炎、宮頸糜爛、濕疹及陰部瘙癢等癥屬濕熱者[1]。處方中君藥黃柏的主要活性成分為生物堿,其中鹽酸小檗堿是含量最高的生物堿,可達(dá)1.4%～5.8%[2], 體外研究[3-5]表明，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿均具有較強(qiáng)的抗炎作用和抗菌能力以及廣泛的抗菌譜。臣藥蛇床子主要成分是香豆素類化合物，如蛇床子素等,蛇床子素具有抑制炎癥發(fā)生、抗過敏等作用[6-7]。這三個(gè)成分是該藥發(fā)揮臨床療效的主要化學(xué)成分，原標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)這三個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，使得制劑質(zhì)量難以得到有效控制。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，制定了與臨床療效相關(guān)成分的含量控制方法，對(duì)增強(qiáng)藥品質(zhì)量可控性，保證臨床用藥安全性，具有十分重要的意義，為進(jìn)一步提高和完善藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo Fisher HPLC色譜儀(U3000) Chromeleon色譜工作站；梅特勒托利多 XSE205DU電子天平(十萬分之一)；超聲波清洗儀 KQ-300DE

1.2 試劑 水為I級(jí)純化水，乙腈(HoneyWell，批號(hào)：T8FA1H)為色譜純，磷酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190301)為優(yōu)級(jí)純、十二烷基硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160413)為分析純。

鹽酸巴馬汀對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110732-201913，含量85.7%)；蛇床子素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110822-202111，含量99.7%)；鹽酸小檗堿對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110713-202015，含量85.9%)。

苦柏洗劑由受委托生產(chǎn)企業(yè)岳陽(yáng)新華達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為200701、201201、210301、210701。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zafex Acutfex PA-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈(63∶37)，流速:1.0 mL·min-1，PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸巴馬汀對(duì)照品15.24 mg，蛇床子素對(duì)照品16.35 mg，鹽酸小檗堿對(duì)照品23.80 mg，分別加甲醇制成每1 mL含鹽酸巴馬汀32.65 μg·mL-1，蛇床子素16.30 μg·mL-1，鹽酸小檗堿817.77 μg·mL-1的溶液，作為儲(chǔ)備液備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品3瓶?jī)?nèi)容物混勻，離心，精密取上清液10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇8 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按苦柏洗劑的處方和制備工藝，分別制備缺黃柏和蛇床子的陰性樣品，再按2.2.2供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣12 μL，色譜圖如圖1。峰形對(duì)稱尖銳，基線平穩(wěn)，各峰之間的分離度為2.17、3.54，達(dá)到基線分離，陰性樣品在三個(gè)主峰位置無干擾峰，如圖1所示。

(A)混合對(duì)照品 (B)苦柏洗劑樣品

(C)缺黃柏陰性樣品 (D)缺蛇床子陰性樣品1.鹽酸巴馬??；2.蛇床子素；3.鹽酸小檗堿圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成含鹽酸巴馬汀0.6530 μg·mL-1、1.3061 μg·mL-1、1.6326 μg·mL-1、3.2652 μg·mL-1、6.5303 μg·mL-1、9.7955 μg·mL-1，蛇床子素0.3260 μg·mL-1、0.6520 μg·mL-1、0.8150 μg·mL-1、1.6301 μg·mL-1、3.2602 μg·mL-1、4.8903 μg·mL-1，鹽酸小檗堿16.3554 μg·mL-1、32.7107 μg·mL-1、40.8884 μg·mL-1、81.7768 μg·mL-1、163.5536 μg·mL-1、245.3304 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣體積為10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以各對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次12 μL，計(jì)算得到鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.29%、1.01%和0.37%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(210301)樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下供試品液制備方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量RSD分別為：1.17%、1.23%和1.79%，表明本法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液(批號(hào)：210301)在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h分別進(jìn)樣12 μL，依法測(cè)定，鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為：0.72%、0.71%和0.34%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量(鹽酸巴馬?。?.462 μg·mL-1,蛇床子素：1.270 μg·mL-1，鹽酸小檗堿：59.434 μg·mL-1)的同一樣品(批號(hào)：210301)6份，各5 mL置20 mL容量瓶中，各加水5 mL，精密加入含鹽酸巴馬汀(8.490 μg·mL-1)、蛇床子素(4.108 mg·mL-1)和鹽酸小檗堿(216.450 μg·mL-1)的混合對(duì)照品溶液1.5mL，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按樣品測(cè)定方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2(續(xù))

2.9 樣品測(cè)定 取四批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表3。

表3 苦柏洗劑中鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 通過查閱文獻(xiàn)[8-11],在實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈，甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺，乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)及多個(gè)比例，經(jīng)過反復(fù)比較，采用0.1%磷酸溶液(含15%乙腈和0.2%十二烷基硫酸鈉)-乙腈(63∶37)進(jìn)行洗脫，鹽酸巴馬汀、蛇床子素、鹽酸小檗堿與相鄰峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱性好，理論塔板數(shù)均在20000以上。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)不同，其紫外最大吸收波長(zhǎng)也不同。采用PDA檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿在346 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，蛇床子素在322 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，為提高檢測(cè)靈敏度，因此選擇322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦柏洗劑中指標(biāo)性成分的提取方法進(jìn)行了探索，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿屬于異喹啉生物堿，蛇床子素屬于香豆素類，均不溶于石油醚。分別考察了萃取和超聲兩種提取方法，結(jié)果顯示用石油醚(30～60 ℃)萃取除雜或者用二氯甲烷提取樣品，雜質(zhì)成分減少，但主成分也會(huì)有所損失，且操作繁瑣。取樣品溶液加甲醇超聲提取，結(jié)果樣品中其他成分峰對(duì)主峰無干擾，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便。同時(shí)比較了不同的超聲時(shí)間(10 min、20 min和30 min)，結(jié)果超聲20 min樣品含量最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇用甲醇超聲20 min的方法提取樣品。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法法測(cè)定苦柏洗劑中的鹽酸巴馬汀、蛇床子素和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，為進(jìn)一步提高、完善原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制苦柏洗劑的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。