巫山廟宇黨參地上部分主要有效成分研究*

鄭慧慧 ，徐 沖 ，祝慧鳳

（1. 重慶市中醫(yī)院，重慶 400021； 2. 西南大學(xué)，重慶 400716）

廟宇黨參又名“單枝黨”，主要產(chǎn)地為重慶市巫山縣廟宇鎮(zhèn)、紅椿土家族鄉(xiāng)、篤坪鄉(xiāng)等。黨參藥材藥用歷史悠久，首載于清代《增訂本草備要》［1］，為臨床常用大宗中藥材，味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，有健脾益肺、養(yǎng)血生津功效［2］。作為多年生常用中藥材，黨參的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，最佳采收年限為3 年，最佳采收期為當(dāng)年9 月至次年1 月［3-5］。黨參多以地下根部入藥。研究顯示，其地上部分（包括莖、葉、花、果）具有一定的藥理作用和功效，有助于根的生長(zhǎng)［6］。黨參莖、葉可促進(jìn)豬和肉仔雞的生長(zhǎng)發(fā)育［7］；黨參花可調(diào)節(jié)人體機(jī)能，增進(jìn)食欲，改善睡眠［8］。但黨參地上部分較少被有效利用，造成了中藥資源的浪費(fèi)。前期研究中，本課題組比較了巫山廟宇黨參蘆頭、根、莖、葉化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)莖、葉、根化學(xué)成分差異較小，故巫山廟宇黨參被棄之為廢的地上部分可能具有較好的生物活性，具備進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力［6］。本研究中比較了巫山廟宇黨參地上部分和地下部分的主要有效成分黨參炔苷、黨參多糖、黨參總皂苷的差異，為其地上部分的開發(fā)利用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1260型液相色譜儀（安捷倫科技<中國(guó)>有限公司）；MS205DU 型電子天平（重慶市瑞利電子儀器設(shè)備有限公司，精度為0.000 1 g）；QUINTIX65-1CN型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，精度為0.01 mg）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；QH-101-2A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AXLM1820-2 型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司，功率為180 W，頻率為50 kHz）；UV - 2450 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DRHH - S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SL - 100 型和SL -1000A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市松青五金廠）。

試藥：黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為111732- 201607，純度≥98%），D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為110833-201506，純度為99.9%），人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為110754 - 201827，純度為93.4%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；香草醛（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為201804190）；水飽和正丁醇［9］、5% 香草醛 - 冰醋酸溶液［9］、5%苯酚溶液［10］（實(shí)驗(yàn)室自制）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；乙醇、苯酚、硫酸、正丁醇、石油醚、高氯酸、冰醋酸均為分析純；黨參分別采自重慶市巫山縣廟宇鎮(zhèn)、紅椿土家族鄉(xiāng)、篤坪鄉(xiāng)，經(jīng)重慶市中藥研究院彭銳研究員鑒定為桔?？拼h參的地上部分和地下部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 黨參炔苷含量測(cè)定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱為DIKMA C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min 時(shí)5%A，5～10 min時(shí) 5%A → 10%A，10～25 min 時(shí) 10%A → 15%A，25～30 min 時(shí) 15%A → 20%A，30～51 min 時(shí) 20% A→28%A，51～70 min 時(shí) 28%A → 50%A，70～80 min 時(shí)50%A → 70%A）；流速為 0.8 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm；柱溫為30.0 ℃；進(jìn)樣量為10μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

溶液制備：取黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)品4.08 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.408 mg/mL 的對(duì)照品溶液。取巫山廟宇黨參地上部分和地下部分，分別切段，60 ℃恒溫干燥，打粉，過4號(hào)篩（65 目）。取地上部分和地下部分粉末各1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ蕿?80 W，頻率為50 kHz，下同）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，靜置，濾過，取濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察：1）線性關(guān)系考察。精密量取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 036.3X-6.169 5（R2=0.999 5，n=7）。結(jié)果表明，黨參炔苷進(jìn)樣量在0.040 8～0.816 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。2）精密度試驗(yàn)。相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%，相對(duì)峰面積的RSD為0.87%，表明儀器精密度良好。3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.05%，相對(duì)峰面積的RSD為0.71%，表明黨參炔苷供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。4）重復(fù)性試驗(yàn)。相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.14%，相對(duì)峰面積的RSD為0.38%，表明方法重復(fù)性良好。5）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。平均加樣回收率為99.76%，RSD為0.76%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2 黨參多糖含量測(cè)定

測(cè)定方法：采用苯酚- 硫酸比色法測(cè)定黨參多糖的含量，采用紫外可見分光光度計(jì)掃描D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液在440～540 nm 波長(zhǎng)間的吸光度，最終確定最佳吸收波長(zhǎng)為490 nm［10-12］。

溶液制備：將D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（溫度為105 ℃）中干燥至恒定質(zhì)量，取11.60 mg，精密稱定，加超純水溶解，定容至100 mL，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.116 mg/mL 的對(duì)照品溶液。取巫山廟宇黨參地上部分和地下部分，分別切段，60 ℃恒溫干燥，打粉，過4 號(hào)篩（65 目）。取地下部分粉末0.1 g、地上部分粉末0.2 g，精密稱定，各3 份，分別置250 mL具塞錐形瓶中，加80%乙醇50 mL，超聲提取30 min，濾過；濾渣和濾紙置錐形瓶中，加超純水80 mL，超聲提取30 min，濾過，重復(fù)1 次，洗滌濾渣和濾紙2 次，合并水提液和洗液，置250 mL 容量瓶中定容，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察：1）線性關(guān)系考察。精密量取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，分別置具塞試管中，加超純水至2.0 mL，同時(shí)以2.0 mL超純水為空白溶液。精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫放置10 min，置40 ℃恒溫水浴鍋中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫。采用紫外可見分光光度計(jì)于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［13］，以最大吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 0.013 5X- 0.058（R2= 0.999 3，n= 7）。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度在11.600～81.200μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。2）精密度試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為0.06%，表明儀器精密度良好。3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為1.49%，表明供試品溶液在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良。4）重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為1.56%，表明方法重復(fù)性良好。5）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。平均加樣回收率為99.91%，RSD為1.77%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.3 黨參總皂苷含量測(cè)定

測(cè)定方法：選擇香草醛-高氯酸作為顯色劑，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定黨參總皂苷的含量，參考文獻(xiàn)［9，14］，以人參皂苷Re作為對(duì)照品，確定最佳吸收波長(zhǎng)為560 nm。

溶液制備：取人參皂苷Re對(duì)照品9.410 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1.882 mg/mL 的對(duì)照品溶液。取巫山廟宇黨參地上部分和地下部分，分別切段，60 ℃恒溫干燥，打粉，過4 號(hào)篩（65 目）。取地上部分粉末1.0 g、地下部分粉末0.2 g，精密稱定，各加入甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過；濾液揮干溶劑，加10 mL 超純水溶解，加入相同體積石油醚，萃取3次，棄去石油醚液，下層液用等量水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，揮干正丁醇，加入甲醇，置10 mL容量瓶中并定容，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察：1）線性關(guān)系考察。精密量取對(duì)照品溶液40，80，120，160，200 μL，置干燥具塞試管中，分別補(bǔ)足甲醇至200μL，同時(shí)以200μL甲醇為空白溶液。置冰水浴中，滴加新配的5%香草醛-冰醋酸溶液200μL和高氯酸溶液800 μL，混勻，置60 ℃水浴中保溫15 min，取出，立即置冰水浴中冷卻5 min，取出，加冰醋酸5 mL。采用紫外可見分光光度計(jì)于560 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［13］，以最大吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、含量（X，μg）為橫坐進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.001 8X-0.050 9（R2= 0.997 7，n= 5）。結(jié)果表明，人參皂苷Re 含量在75.28～376.40 μg 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。2）精密度試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為0，表明儀器精密度良好。3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為1.68%，表明人參皂苷Re供試品溶液在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。4）重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果的RSD為2.06%，表明方法重復(fù)性良好。5）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。平均加樣回收率為99.16%，RSD為1.29%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 地上部分與地下部分含量比較

巫山廟宇黨參地上部分和地下部分均含有主要有效成分黨參炔苷、黨參多糖及黨參皂苷。其中，地上部分黨參炔苷的含量約占地下部分的42.95%；黨參多糖的含量約占地下部分的9.65%；黨參總皂苷的含量約占地下部分的29.00%。詳見表1。

表1 巫山廟宇黨參地上部分和地下部分主要有效成分含量比較（，mg/g，n=3）Tab.1 Comparison of the contents of main active ingredients in the aboveground and underground parts of Miaoyu Codonopsis Radix in Wushan（，mg/g，n=3）

表1 巫山廟宇黨參地上部分和地下部分主要有效成分含量比較（，mg/g，n=3）Tab.1 Comparison of the contents of main active ingredients in the aboveground and underground parts of Miaoyu Codonopsis Radix in Wushan（，mg/g，n=3）

注：a為紅椿土家族鄉(xiāng)，b為廟宇鎮(zhèn)，c為篤坪鄉(xiāng)。Note：a refers to Hongchun Tujia Township，b refers to Miaoyu Town，and c refers to Duping Township.

成分黨參炔苷產(chǎn)地X X a b c a b c a b c地上部分0.315±0.254 1.056±0.621 0.491±0.220 31.573±2.180 31.838±1.145 33.601±1.393 14.408±0.436 13.103±0.522 13.240±0.365 0.621±0.2221.446±0.073黨參多糖32.337±0.541334.998±4.465黨參皂苷13.584±0.717地下部分1.265±0.183 1.807±0.314 1.267±0.195 299.480±11.562 332.763±15.878 372.752±6.950 39.982±3.173 58.294±1.657 42.237±4.479 46.838±9.985

3 討論

黨參藥理作用有效且廣泛，對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均有影響［15-16］。黨參多糖具有提高抵抗力、增強(qiáng)造血功能、降低血糖、抗輻射損傷的功效；對(duì)動(dòng)物常壓缺氧、組織細(xì)胞缺氧、循環(huán)障礙缺氧及增加耗氧所致缺氧均有良好的對(duì)抗或耐受作用，對(duì)心、腦等重要器官缺氧有保護(hù)作用；還可消除細(xì)胞自由基、延遲細(xì)胞凋亡［17-18］。黨參炔苷是黨參質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分之一，除具有抗癌、抗菌、抗炎等作用外，還能有效保護(hù)機(jī)體胃黏膜損傷［19］。黨參皂苷不僅具有較好的抗氧化作用［20］，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫［21-24］。本研究結(jié)果顯示，巫山廟宇黨參地上部分和地下部分均含有黨參多糖、黨參炔苷及黨參皂苷，僅含量有差異，故巫山廟宇黨參地上部分可能具有地下部分相似的藥理作用。

黨參地下部分藥理作用豐富而突出，市場(chǎng)和臨床使用量較大；地上部分盡管產(chǎn)出量大，研究卻嚴(yán)重滯后，未能得到充分利用。若進(jìn)一步對(duì)巫山廟宇黨參地上部分進(jìn)行綜合開發(fā)與利用，作為地下部分的替代品或應(yīng)用于其他方面，如制成獸用飼料、添加劑等，有望促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，改善肉質(zhì)，提高動(dòng)物抗病能力等，具有重要的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。