新城疫病毒抗惡性腫瘤研究進(jìn)展

陳云嬌，屈陽(yáng)陽(yáng)，李 杰，賈偉娟，郗珊珊，何云江，孟慶磊，王學(xué)理

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042；2通遼市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古通遼 028001；3通遼市庫(kù)倫旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古通遼 028200）

0 引言

新城疫(newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，可感染250多種禽類[1-3]。該病通過(guò)侵害心血管系統(tǒng)，造成血液循環(huán)高度障礙，從而引起全身性炎性出血、水腫。疾病后期，病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起非化膿性腦炎變化，導(dǎo)致神經(jīng)癥狀出現(xiàn)[4-6]。NDV主要感染禽類，人感染的情況十分少見(jiàn)，但感染后可導(dǎo)致結(jié)膜炎和流感等癥狀。該病最早出現(xiàn)在印度尼西亞的爪哇(Java)和英國(guó)的新城(Newcastle)，1927年Doyle首次分離出病原，并將該病命名為新城疫[7]。

惡性腫瘤在中國(guó)發(fā)病率較高，已成為人類死亡的主要原因之一[8]。目前使用的治療方案并沒(méi)有很大程度地提高惡性腫瘤患者的生存率，因?yàn)樗鼈兊闹委熜Ч钟邢轠9-11]。自20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)NDV能夠抑制晚期胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移以來(lái)，許多研究已經(jīng)證實(shí)NDV可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能刺激免疫系統(tǒng)以提高機(jī)體自身的抗腫瘤能力[12-13]。

1 NDV概況

NDV屬副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬。為單鏈負(fù)股RNA病毒，整個(gè)病毒粒子有囊膜，直徑大小約100～400 nm，從形態(tài)學(xué)來(lái)看，NDV為一個(gè)多形性包膜粒子（如圖1）[14-15]。ND是最具有破壞性的家禽傳染病之一，該病對(duì)商品家禽的生產(chǎn)具有相當(dāng)大的威脅[16-18]。從1926年英格蘭泰恩河畔紐卡斯?fàn)柕牡谝淮喂俜綀?bào)告至今，許多國(guó)家都出現(xiàn)了ND爆發(fā)的報(bào)告，由于其具有高死亡率、高發(fā)病率的特征，在世界各地造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[19]。NDV可分為I類和II類，I類包含1個(gè)基因型，II類包含21個(gè)基因型(I-XXI)，新城疫病毒感染和特異性殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的能力，取決于病毒的毒株和致病類型[20-23]。盡管新城疫病毒是以禽類為天然宿主的病毒，但其已被多項(xiàng)研究證實(shí)是一種安全有效的溶瘤病毒，當(dāng)前已有多個(gè)新城疫毒株用以臨床溶瘤研究[24-26]。

圖1 新城疫病毒的結(jié)構(gòu)特征

2 NDV抗惡性腫瘤作用機(jī)制

2.1 NDV病毒的溶瘤作用機(jī)制

目前，癌癥是人類的致命疾病之一，盡管現(xiàn)代治療方式有所改善，但仍需要新的治療措施的出現(xiàn)來(lái)降低致死率。溶瘤病毒療法是治療癌癥的很有前景的非傳統(tǒng)方式[27]。作為溶瘤病毒之一的新城疫病毒，通過(guò)在特定的腫瘤細(xì)胞中不斷增殖，從而導(dǎo)致該細(xì)胞溶解。該病毒不能在人健康細(xì)胞中復(fù)制，具有較好的安全性（如圖2）[28-29]。徐全宇等[30]通過(guò)在裸小鼠體內(nèi)建立人肺腺癌細(xì)胞系移植瘤動(dòng)物模型，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在其中一組小鼠的移植瘤體內(nèi)局部注射N(xiāo)DV以及攜帶HN、F基因的質(zhì)粒（pSV HN和pSV F）作抗腫瘤研究，并且設(shè)置PBS對(duì)照組。研究顯示，實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑瘤率高達(dá)79.40%。WANG等[31]在有前列腺癌細(xì)胞源性腫瘤的裸鼠體內(nèi)注射溶瘤新城疫病毒FMW株，利用模擬處理的腫瘤生長(zhǎng)組作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞被NDV-FMw感染后腫瘤生長(zhǎng)比模擬處理后生長(zhǎng)得更小。溶瘤新城疫病毒激活了前列腺癌細(xì)胞中腫瘤免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)標(biāo)志物的表達(dá)，抑制了STAT 3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）和溶瘤NDV的結(jié)合，提高了NDV的抗腫瘤效應(yīng)。郭順利[32]為了能夠提高NDV的溶瘤效果，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建并獲取能表達(dá)IP10蛋白的重組新城疫病毒(rNDV-IP10)，同時(shí)檢測(cè)了rNDV-IP10殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。將H22肝癌小鼠模型隨機(jī)分為3組，分別注射PBS、NDV和rNDV-IP10，觀察12天并測(cè)量腫瘤體積大小。結(jié)果顯示，rNDV-IP10組實(shí)驗(yàn)鼠與PBS組、NDV組相比腫瘤生長(zhǎng)較慢，腫瘤體積小于0.05。結(jié)果說(shuō)明rNDV-IP10在肝癌動(dòng)物模型中具有更好的抑瘤效果。

圖2 NDV溶瘤作用機(jī)制

病毒性溶瘤是免疫治療的重要途徑之一，相比傳統(tǒng)的化療或放療方法，其特異性更高、安全性良好且副作用更小[33]。溶瘤病毒可以通過(guò)直接感染、裂解癌細(xì)胞、激活免疫系統(tǒng)等途徑發(fā)揮抑瘤或消除腫瘤的作用。由此可見(jiàn)，NDV可作為一種安全的溶瘤制劑或者腫瘤疫苗載體。

2.2 發(fā)揮抑瘤佐劑作用

在新城疫病毒發(fā)揮抗惡性腫瘤作用時(shí)，病毒中某些基因會(huì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制其生長(zhǎng)的輔助作用。NI等[34]以編碼NDV血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白的質(zhì)粒刺激荷瘤小鼠來(lái)研究先天性抗腫瘤活性的能力，并設(shè)立了未編碼HN的對(duì)照質(zhì)粒組。結(jié)果顯示，與不編碼HN蛋白的對(duì)照質(zhì)粒相比，接種pHN DNA質(zhì)粒后，小鼠NK細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，降低腫瘤生長(zhǎng)，pHN質(zhì)粒在小鼠耳咽部可以激活腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，這表明了HN基因在腫瘤治療中具有一定的潛在佐劑活性。馬洪琴[35]為了研究和分析NDV抗膀胱癌的作用效果，采用小鼠膀胱腫瘤模型(BST739)進(jìn)行研究，分別將卡介苗(BCG)、絲裂霉素(MMC)以及NDV病毒注入小鼠膀胱腫瘤內(nèi)及腫瘤對(duì)側(cè)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)變化。結(jié)果顯示，BCG、MMC和NDV對(duì)膀胱癌細(xì)胞均具有一定的殺傷作用，且NDV試驗(yàn)組的2種注射方式均能夠?qū)δ[瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，且注射至瘤內(nèi)相比于注射瘤對(duì)側(cè)的效果更顯著。郭靈華等[36]通過(guò)雞胚增殖新城疫病毒LX/(IL-7)，首先用200 μg/mL絲裂霉素C處理2×107CFU/mL Hepa1-6細(xì)胞，再將LX/(IL-7)病毒感染處理過(guò)的細(xì)胞，制成疫苗，將疫苗注射至小鼠肝癌模型中。對(duì)照組小鼠皮下接種1×106個(gè)絲裂霉素C處理的Hepa1-6細(xì)胞，通過(guò)測(cè)量腫瘤體積來(lái)研究腫瘤疫苗的抗肝癌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠腫瘤體積是實(shí)驗(yàn)組的4倍左右。說(shuō)明LX/(IL-7)病毒可以高效地感染肝癌細(xì)胞并分泌IL-7。經(jīng)LX/(IL-7)修飾的Hepa1-6瘤苗具有較好的腫瘤免疫治療效果，攜帶IL-7的新城疫病毒腫瘤疫苗具有顯著抗肝癌作用。

以上研究結(jié)果表明，抑瘤佐劑作用在抗腫瘤過(guò)程中效果十分顯著，可有效的控制惡性腫瘤的生長(zhǎng)，減少癌細(xì)胞的擴(kuò)散。探明NDV的抑瘤佐劑機(jī)制，為在不遠(yuǎn)的將來(lái)在臨床利用新城疫病毒治療惡性腫瘤提供了很大的可能。

2.3 增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性

NDV在抗惡性腫瘤的過(guò)程中，可以增強(qiáng)參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞的活性，從而強(qiáng)化病毒抗惡性腫瘤的作用[37]。APOSTOLIDIS等[38]鑒定了一些NDV毒株的抗腫瘤特性，篩選出溶瘤株MTH-68/H是最強(qiáng)的α干擾素誘導(dǎo)劑，經(jīng)紫外線滅活后，它是唯一一株在體外誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤活性的NDV株。使用局部應(yīng)用模型來(lái)治療熒光素酶轉(zhuǎn)染的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移時(shí)，溶瘤株MTH-68/H表現(xiàn)出明顯的延緩腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生存期，局部區(qū)域應(yīng)用新城疫病毒溶瘤比全身靜脈注射更有效。李德山等[39]利用重組新城疫病毒(rNDA)治療肝癌肺轉(zhuǎn)移鼠，將免疫調(diào)節(jié)基因白細(xì)胞介素2(IL2)插入rNDV基因組，獲得病毒株rNDV-IL2。通過(guò)MTT法檢驗(yàn)rNDV-IL2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞體外抑制效果。通過(guò)小鼠尾靜脈注射H22肝癌細(xì)胞，構(gòu)建肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型，在小鼠腹腔注射rNDV和rNDV-IL2，治療肝癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠，未治療組作對(duì)照，觀察小鼠存活情況。結(jié)果表明，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠30天成活率分別為0.50%和77.8%。rNDV-IL2有效感染HepG2細(xì)胞，表達(dá)外源基因IL2并抑制HepG2細(xì)胞增殖。重組新城疫病毒rNDV-IL2治療試驗(yàn)動(dòng)物后，體內(nèi)的IL2基因表達(dá)量提高，重組新城疫病毒有效控制轉(zhuǎn)移灶形成，且顯著促進(jìn)了T細(xì)胞的增殖，提高了試驗(yàn)動(dòng)物的存活率。

2.4 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

NDV能刺激和增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞系的殺傷能力，在腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的抗腫瘤活性中起重要作用（如圖3）[40]。其原理是新城疫病毒能中和IFN-γ抗體，消除NDV對(duì)TRAIL表達(dá)的抑制，進(jìn)而增強(qiáng)NK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。研究發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡可能與B淋巴母細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)含有相同的結(jié)構(gòu)域有關(guān)，而bcl已被證明是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的重要基因之一[41]。白海[42]從近50株新城疫毒株中篩選出一株被命名為NDV-FMW的病毒株，通過(guò)MTT方法篩選出該病毒株對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549和肝癌細(xì)胞株SMMC 7721等腫瘤株都具有較好的抑制作用。結(jié)果表明，在24 h時(shí)，出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞變圓；48 h時(shí)，細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，透光性變差；72 h時(shí)，大量細(xì)胞死亡。NDV-FMW株的抑制率可達(dá)到60%以上，該毒株能夠激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞死亡抑制腫瘤生長(zhǎng)。薛立娟等[43]以PIRESlneo為表達(dá)載體構(gòu)建了NDV HN基因的p IRHN載體疫苗，在體外轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測(cè)p IRHN在真核細(xì)胞當(dāng)中的表達(dá)狀況，同時(shí)測(cè)定HeLa細(xì)胞唾液酸含量的變化。結(jié)果顯示，p IRHN能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，能夠使HeLa細(xì)胞唾液酸含量減少，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，表明了其死亡方式主要以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，通過(guò)其表達(dá)產(chǎn)物與腫瘤細(xì)胞唾液酸受體的相互作用，發(fā)揮其抗腫瘤作用。米志強(qiáng)等[44]以p VAX1為表達(dá)載體構(gòu)建了含NDV HN基因的p VHN載體疫苗進(jìn)行體內(nèi)外的抗腫瘤研究。結(jié)果顯示，含HN的載體疫苗pVHN表達(dá)后具有血凝活性并致腫瘤細(xì)胞表面唾液酸含量降低(P＜0.05)。pVVP3的轉(zhuǎn)染能導(dǎo)致OS732細(xì)胞凋亡，凋亡率可達(dá)87%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pVVP3和pVHN兩個(gè)載體疫苗體外應(yīng)用后能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并顯著降低腫瘤細(xì)胞表面唾液酸含量。白楊[45]為了觀察NDV對(duì)膠質(zhì)瘤是否有輔助治療作用，將NDV注射到患有惡性腫瘤的Wister大鼠體內(nèi)并觀察。結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NDV可以通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中活化的內(nèi)源性蛋白激酶B(Akt)及其下游分子同時(shí)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。以上結(jié)果表明，NDV能使惡性腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位降低，使腫瘤細(xì)胞凋亡，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在新城疫病毒抗惡性腫瘤機(jī)制中起著重要作用，已成為治療腫瘤的理想方法。

圖3 NDV誘導(dǎo)免疫細(xì)胞作用機(jī)制

3 展望

新城疫是具有高度傳染性的禽類疾病，給許多國(guó)家的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，但是NDV在治療惡性腫瘤方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)，NDV可以選擇性地感染人類腫瘤組織，能在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中選擇性的復(fù)制而不依賴于細(xì)胞的增殖，通過(guò)直接殺死癌細(xì)胞或吸引免疫細(xì)胞等方式來(lái)清除被感染的腫瘤細(xì)胞，屬于非致病性的病毒[46-47]。從20世紀(jì)60年代至今，研究人員已對(duì)73-T、MTH-68、PV701、HUJ和LaSota等NDV減毒株或弱毒株開(kāi)始了Ⅰ期、Ⅱ期以及Ⅲ期藥物的臨床試驗(yàn)，觀察到大部分病例有較好的療效，但是許多臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)NDV外源基因插入位點(diǎn)、NDV注射時(shí)間及注射次數(shù)控制不好的問(wèn)題，且臨床總體例數(shù)較少，未有重復(fù)試驗(yàn)，說(shuō)明現(xiàn)有的NDV弱毒株或減毒株的治療方法還存在不足，不能廣泛使用[48-51]。因此，急需探索出治療腫瘤時(shí)插入NDV的外源基因最佳位點(diǎn)，使外源治療基因能夠達(dá)到最高表達(dá)水平，且對(duì)NDV在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制影響最小，同時(shí)，也要不斷探索最佳注射時(shí)間和注射次數(shù)以優(yōu)化臨床治療腫瘤的效果，研發(fā)出更為高效的重組新城疫疫苗來(lái)降低腫瘤的發(fā)病率和致死率。