印度梨形孢定殖策略和促生機(jī)制研究進(jìn)展

武明雅，陳俊強(qiáng)，馬海林，劉方春，劉丙花，劉幸紅，司東霞

（1聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東聊城 252000；2山東省林業(yè)科學(xué)研究院，濟(jì)南 250014）

0 引言

印度梨形孢(Serendipita indica)是一種內(nèi)生真菌，屬于擔(dān)子菌門，由印度科學(xué)家VERMA等[1]在印度塔爾沙漠的灌木根中分離得到。印度梨形孢定殖范圍十分廣泛，目前已知印度梨形孢可以與12個科約150種植物建立共生關(guān)系，包括非菌根植物和叢枝菌根真菌不能定殖的十字花科植物中[2]。

印度梨形孢最大的特點(diǎn)在于能與寄主植物共生，緩解植物受到的生物脅迫和非生物脅迫，通過各種不同的方式促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高花朵、種子或果實(shí)產(chǎn)量，改善其品質(zhì)。同時，印度梨形孢起到生物肥料和生物修復(fù)劑的作用，改善土壤營養(yǎng)、修復(fù)土壤污染狀況[2]。但由于植物-微生物形成區(qū)域的復(fù)雜性，對印度梨形孢在寄主植物的定殖策略及作用機(jī)制的認(rèn)識還非常有限，使得印度梨形孢的應(yīng)用受到限制。為此本文聚焦印度梨形孢定殖策略及作用機(jī)制，總結(jié)了其國內(nèi)外最新研究進(jìn)展，并對未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望，旨在系統(tǒng)認(rèn)識印度梨形孢作用效果及促生機(jī)制，并從中尋找新的突破點(diǎn)，以期為進(jìn)一步充分發(fā)揮印度梨形孢在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、花卉園藝業(yè)中的應(yīng)用潛力提供依據(jù)。

1 印度梨形孢的特點(diǎn)

1.1 印度梨形孢形態(tài)特點(diǎn)

在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)印度梨形孢（圖1），觀察到菌落形態(tài)緊密，布滿皺紋。菌絲呈白色，高度交織，通常粘附在一起，形成簡單的線狀結(jié)構(gòu)。定殖植物根系內(nèi)部后，形成梨形厚垣孢子（圖2），單獨(dú)或成簇出現(xiàn)，孢子長度約15～25 μm，寬度約10～17 μm。未成熟孢子的壁薄而透明，成熟后的孢子的壁呈兩層，厚約1.5 μm，表面為光滑的淡黃色。每個孢子通常含有8～25個細(xì)胞核[1]。

圖1 PDA培養(yǎng)基中的印度梨形孢

圖2 印度梨形孢厚垣孢子

1.2 印度梨形孢功能特點(diǎn)

印度梨形孢與叢枝菌根真菌(AM)相似，兩者均能與植物共生，產(chǎn)生積極的共生效應(yīng)（表1）。不同的是，印度梨形孢可以在人工培養(yǎng)基中無菌生長，完成其生活史。對比分別使用印度梨形孢和叢枝菌根真菌的植株，和叢枝菌根真菌形成共生關(guān)系的大麥P和N含量更高[3]，但印度梨形孢定殖的微繁殖苗顯示出更高的生存率[4]。將印度梨形孢和植物促生菌（假熒光單胞菌、偶氮螺旋菌）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們在促進(jìn)生長、增加產(chǎn)量、提高耐鹽性和抗病性方面具有相似效果[5-7]，但印度梨形孢在微繁殖植株的促進(jìn)生長和提高成活率方面的作用更為明顯[8-9]。印度梨形孢作為一種多功能的內(nèi)生真菌，其培養(yǎng)方式簡單，寄主范圍廣闊，對寄主植物的促生和提高抗性的作用顯著，這些特點(diǎn)使它和其他有益內(nèi)生菌相比更具優(yōu)勢。

表1 3種內(nèi)生菌對比

印度梨形孢是一種多功能的、具有廣泛適用性的真菌（圖3），定殖后起到生物生長調(diào)節(jié)刺激劑的作用[10]。它通過和植物建立互惠共生關(guān)系增強(qiáng)寄主植物的養(yǎng)分獲取，促進(jìn)寄主生長發(fā)育，提高植物生物量和可食用部分（樹葉、果實(shí)、根莖）以及供觀賞部分（花朵、果實(shí)、樹葉）的數(shù)量和品質(zhì)[11]。同時，印度梨形孢是一種生物保護(hù)劑，通過刺激上調(diào)寄主植物防御系統(tǒng)成分和逆境相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物抗病性和對生物及非生物脅迫的耐受性[12]。在營養(yǎng)限制和受到污染的土壤中，它是一種有效的生物肥料和生物恢復(fù)劑，可以改善土壤養(yǎng)分狀況和修復(fù)土壤健康[13]。

圖3 印度梨形孢的多種功能

2 印度梨形孢定殖策略

2.1 定殖過程

印度梨形孢接觸到植物根系后，首先產(chǎn)生2個分枝的芽管，誘導(dǎo)附著胞的形成。這些附著胞根系細(xì)胞表面產(chǎn)生侵入性的菌絲，穿透表皮和皮層細(xì)胞，完成最初的定殖過程，最終菌絲在成熟的植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生厚垣孢子[14]。印度梨形孢的定殖和細(xì)胞的成熟度密切相關(guān)，菌絲只侵染伸長區(qū)的成熟細(xì)胞或死細(xì)胞，不會侵染植物根系的中央分生組織、中柱鞘和氣生部分[15]。隨著宿主細(xì)胞組織成熟，厚垣孢子定殖數(shù)量逐漸增加，達(dá)到植物根系和真菌數(shù)量的穩(wěn)定水平，最終形成了根系生長和真菌增殖的平衡。在大麥幼苗中接種印度梨形孢，結(jié)果表明，印度梨形孢在成熟的根系細(xì)胞或死亡的根系細(xì)胞中定殖，但不會引起植物的脅迫[16]。在印度梨形孢的定殖過程和植物生長的任何階段中，地上部分始終沒有其菌絲存在[14]。

2.2 定殖策略

印度梨形孢能夠在不同的植物中定殖，說明它已經(jīng)進(jìn)化出了高度有效的定殖策略。植物具有先天的免疫系統(tǒng)來應(yīng)對外來物種的入侵，印度梨形孢通過誘導(dǎo)植物激素（乙烯(ET)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)等）表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)，以平衡天然免疫反應(yīng)和根系定殖過程[17]。當(dāng)植物感受到印度梨形孢接觸時，根系的先天免疫系統(tǒng)立即被激活，隨即產(chǎn)生一種溫和的茉莉酸(JA)限制真菌在根系的快速定殖和生長，乙烯(ET)和赤霉素(GA)等激素紛紛響應(yīng)，表現(xiàn)出激素水平的上調(diào)，以防真菌過度定殖，導(dǎo)致真菌和植物的共生關(guān)系破裂，植物生長受到負(fù)面影響。當(dāng)植物根系生長和印度梨形孢定殖數(shù)量達(dá)到平衡時，植物防御反應(yīng)下調(diào)，植物激素回歸正常水平。相應(yīng)的，不同植物物種建立了不同的機(jī)制來應(yīng)對印度梨形孢的定殖，根系定殖策略和植物激素水平變化是高度特異性的[17]。

研究表明，在擬南芥和大麥中，乙烯是印度梨形孢與兩種植物根系共生的必不可少的因素，乙烯信號的強(qiáng)弱影響印度梨形孢在植物根部的定殖情況，乙烯信號通路受損導(dǎo)致擬南芥和大麥根中定殖的印度梨形孢數(shù)量減少[18]。印度梨形孢定殖擬南芥時，擬南芥根系中赤霉素含量上升，促進(jìn)真菌在根系的定殖。而在赤霉素(GA)合成和感知能力受損的大麥植株中，表現(xiàn)出防御基因的表達(dá)上升，印度梨形孢定殖數(shù)量減少[19]。

2.3 影響定殖的其他因素

印度梨形孢的成功定殖受到多種因素的共同影響。在真菌定殖根系的最初時期，根系中鈣離子(Ca2+)顯著增加，這可能是印度梨形孢定殖的早期信號[11]。At5g16590是一種富含亮氨酸的非典型受體蛋白，是真菌定殖的初始感知和識別的重要因子，為響應(yīng)印度梨形孢的定殖，其信息在擬南芥根部中短暫上調(diào)，這種蛋白的突變體則無法識別印度梨形孢[20]。外部生長素IAA可以積極影響印度梨形孢定殖。適量施用IAA的植株表現(xiàn)出更好的被印度梨形孢定殖，高IAA含量則抑制了印度梨形孢的生長[21]。在最新的報(bào)道中，纖維糖作為一種新的化學(xué)介質(zhì)，在真菌和寄主植物的通信中發(fā)揮重要作用[14]。

3 印度梨形孢促進(jìn)寄主植物生長發(fā)育的應(yīng)用效應(yīng)

3.1 促進(jìn)寄主植物生長

印度梨形孢對寄主植物的生長發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用，這種促生作用貫穿了植物生長的整個周期。在種子階段，印度梨形孢促進(jìn)寄主植物種子提前發(fā)芽；在幼苗階段，增加幼苗活力提高生存率；在營養(yǎng)生長階段，增加植物株高、莖粗、根系發(fā)育、枝條分蘗和分枝；在開花階段，印度梨形孢增加花朵、花序的數(shù)量；在成熟階段，增加種子的數(shù)量和重量，提高可食用部分（谷物、果實(shí)、樹葉）的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、次生代謝物含量和籽油品質(zhì)。

研究表明，印度梨形孢的定殖能夠加快植物幼苗時期的生長速度，縮短營養(yǎng)生長時段的時長，使植物更早轉(zhuǎn)入生殖生長階段[22]。吳金丹等[23]將印度梨形孢和水稻共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與對照相比，印度梨形孢定殖的水稻抽穗期提前4-6天。印度梨形孢對植物生長的促進(jìn)作用可通過增加鮮重或干重來衡量。印度梨形孢與番茄互作，促進(jìn)了番茄的生長，番茄果實(shí)的鮮重增加了100%，干重增加20%[2]。

印度梨形孢對植物的促生作用還表現(xiàn)在促進(jìn)地下部愈傷組織分化[24]和插條快速生根中[25]。DRUEGE等[25]將印度梨形孢應(yīng)用在三種植物的扦插實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種印度梨形孢能明顯加快天竺葵和一品紅扦插不定根的形成，真菌定殖的天竺葵和一品紅不定根數(shù)量和長度均高于對照。但對牽?；ǜ档拇偕饔脛t不明顯，這可能是由于牽?；ǜ蛋l(fā)育迅速的原因。所以將印度梨形孢應(yīng)用于植物快速生根的實(shí)踐中，需要真菌在最短時間內(nèi)定殖并產(chǎn)生促生效應(yīng)。

3.2 提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)

在產(chǎn)品質(zhì)量方面，印度梨形孢定殖的植株各種化合物濃度都有所增加，如提高龍須草的抗菌能力、積雪草中的積雪草苷含量、小茴香和百里香中的精油含量和黑胡椒中的胡椒堿的含量[22,26]。在芹菜、四九黃菜心、馬鈴薯、萵苣等農(nóng)作物中接種印度梨形孢（表2），不僅促生作用明顯，并且顯著提高了這些作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[27-30]。印度梨形孢定殖提高作物產(chǎn)量，使花序和花的數(shù)量增加，獲得更大的種子和果實(shí)的數(shù)量和重量，但這取決于一個具體的收獲期。在番茄的早期的收獲期，印度梨形孢定殖的番茄植株是對照的2倍，但下一個收獲期，對照和處理的收獲量差異并不顯著[2]。像番茄這樣收獲期較長的植物，總體產(chǎn)量并沒有很大差異。

表2 印度梨形孢對植物生長和品質(zhì)的影響

3.3 促進(jìn)花朵發(fā)育

植物的開花受環(huán)境因素和內(nèi)部調(diào)控因素的共同作用。在開花期間，印度梨形孢對植株分蘗數(shù)、花朵數(shù)量、花序、花大小和花期等形狀均有正向的影響（表3）。將印度梨形孢施用在非洲萬壽菊上，發(fā)現(xiàn)其改善了非洲萬壽菊的開花和生理性狀。與對照相比，真菌定殖的萬壽菊葉綠素含量更高、花徑更長、花朵數(shù)量和總體的鮮花產(chǎn)量均有增加[32]。呂祥濤等[33]將印度梨形孢與雜交蘭共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與對照相比，印度梨形孢定殖的植株鮮重、地下部根長、地上部總長度和葉片表面積均有增加。劉慧春等[34]將印度梨形孢接種在文心蘭組培苗上，觀測到孢子定殖在文心蘭根部表皮層，通過表皮細(xì)胞的擴(kuò)增使根部加粗，株高相比于對照增加了70%，鮮重增加了96%。DAS等[35]將印度梨形孢與毛喉鞘蕊花共同培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被定殖的毛喉鞘蕊花開花更早，生物量更高。定殖植株比對照植株平均至少提前7天開花，180天后81%的定殖植株開花，而非定殖植株開花率僅有31%。此外，定殖植株的花序數(shù)量和長度顯著高于非定殖植株。

表3 印度梨形孢對植物開花的影響

4 印度梨形孢作用機(jī)制

4.1 促進(jìn)生長機(jī)制

印度梨形孢成功定殖后，以直接和間接兩種方式改善寄主植物的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)（圖4）[11]。一是直接機(jī)制，印度梨形孢通過分泌物溶解和運(yùn)輸養(yǎng)分，促進(jìn)營養(yǎng)吸收，并吸收土壤中的重金屬，改變植物和土壤的生物化學(xué)狀態(tài)。真菌通過直接向根系運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和將不可用的資源轉(zhuǎn)化稱為植物可用的化合物這兩種方式向植物提供營養(yǎng)，促進(jìn)植物對礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收[36]。例如，印度梨形孢定殖后，產(chǎn)生大量的酸性磷酸酶，將土壤中固定的有機(jī)磷溶解為速效磷，為缺少磷素的植物提供間接的磷素來源。在其他的研究中，印度梨形孢定殖也能減輕Fe、Cu短缺對甘蔗造成的損害；在小扁豆和鷹嘴豆的實(shí)驗(yàn)中，印度梨形孢定殖顯著提高了兩種植物果實(shí)中N、P、K的濃度[14]。

圖4 印度梨形孢作用機(jī)制

二是間接機(jī)制，印度梨形孢接觸植物根系后，植物自身的防御系統(tǒng)立即被觸發(fā)，以茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)、乙烯(ET)為代表的激素水平表達(dá)上調(diào)，應(yīng)對真菌定殖。當(dāng)真菌和根系共生關(guān)系成功建立后，一部分激素，如乙烯回歸正常水平，一部分激素受到印度梨形孢誘導(dǎo)，如細(xì)胞分裂素(CK)、生長素(AUX、IAA)表達(dá)持續(xù)上調(diào)，促進(jìn)了寄主植物的生長[37-39]。大量研究表明，印度梨形孢定殖的植株具有濃密的根表型，根系的快速發(fā)育使寄主植物從土壤中吸收更多的水和礦物質(zhì)，提高葉片葉綠素含量和光合速率[40-42]。此外，印度梨形孢還通過減少抗?fàn)I養(yǎng)成分、產(chǎn)生二次代謝物、生產(chǎn)抗氧化劑、和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等途徑間接參與寄主植物的生長發(fā)育的過程[43-46]。在這些因素的共同作用下，寄主植物生長情況和營養(yǎng)水平得到很大程度的改善。

4.2 促進(jìn)開花機(jī)制

miRNA調(diào)控廣泛的分子過程，它參與植物激素信號傳導(dǎo)和細(xì)胞壁代謝過程[47]。YU等[48]研究表明，有印度梨形孢定殖的蘭花幼苗，地上部和根部發(fā)育更旺盛，根系中miRNA靶基因上調(diào)。印度梨形孢定殖寄主植物根部后，通過調(diào)節(jié)根系中基因表達(dá)，參與根系生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，這個過程伴隨植物根系快速發(fā)育和吸收營養(yǎng)，最終達(dá)到了對植物的花朵發(fā)育和形成的促進(jìn)作用。

在擬南芥中，印度梨形孢定殖18天后，開花激活因子(FT、LFY、API)表達(dá)顯著增加，而開花抑制因子(FLC)的表達(dá)減少。說明印度梨形孢是開花激活因子表達(dá)的正調(diào)控因子，是開花抑制因子的負(fù)調(diào)控因子，印度梨形孢控制擬南芥開花基因的表達(dá)[49]。同時，印度梨形孢促進(jìn)了赤霉素(GA)的生物合成，通過調(diào)節(jié)GA生物合成基因的表達(dá)促進(jìn)擬南芥早花。印度梨形孢和擬南芥共培養(yǎng)13天后，和對照相比，接種印度梨形孢的擬南芥GA3表達(dá)了增加了約5倍[49]。接種了印度梨形孢的擬南芥植株表現(xiàn)出明顯的早花類型，開花調(diào)節(jié)基因和赤霉素合成基因被激活，赤霉素含量增加，從而導(dǎo)致了擬南芥的早花效應(yīng)。

4.3 次生代謝物

在研究印度梨形孢對植物生長發(fā)育的作用的試驗(yàn)中，通常將印度梨形孢菌塊投入PDB液體培養(yǎng)基中（200 g馬鈴薯；20 g葡萄糖）震蕩培養(yǎng)10天，獲得印度梨形孢培養(yǎng)液，用此與植物共生，產(chǎn)生促生效應(yīng)。但在最近的研究中，發(fā)現(xiàn)印度梨形孢培養(yǎng)過濾液對植株生長的也有明顯的促進(jìn)作用。在曲霉菌肉湯中培養(yǎng)印度梨形孢15天后，用4層無菌棉布過濾出真菌，將培養(yǎng)過濾液用于馬鈴薯中，發(fā)現(xiàn)根數(shù)、根長、株高、葉數(shù)和植株生物量均有提高[50]。印度梨形孢培養(yǎng)濾液也促進(jìn)了黃花蒿、亞麻和向日葵的生長，提高了向日葵整體生長量和種子產(chǎn)量[50-51]。這一發(fā)現(xiàn)為未來印度梨形孢走出實(shí)驗(yàn)室，作為生物菌肥進(jìn)行量產(chǎn)，并投入農(nóng)、林、花卉市場作的具體實(shí)踐提供了另一條可實(shí)現(xiàn)的途徑。

5 展望

綜合前文所述，印度梨形孢被認(rèn)為是植物生長促進(jìn)劑、生物肥料、生物除草劑、免疫調(diào)節(jié)劑和植物土壤修復(fù)劑，在生產(chǎn)實(shí)踐中使用印度梨形孢，可以減少化肥農(nóng)藥的施用，對土壤和生態(tài)環(huán)境友好，在未來發(fā)展中具有很大的潛力。然而，盡管現(xiàn)階段學(xué)者們闡明了印度梨形孢與植物相互作用中的一些拼圖，但由于植物生長環(huán)境的復(fù)雜性，很多作用機(jī)制仍有待探明，如PGPR產(chǎn)生的各種化合物及其在植物-微生物之間充當(dāng)?shù)慕巧?；印度梨形孢與根際其他土著微生物定殖的策略差異性；以及野外應(yīng)用的實(shí)際效率等。作為一種正在研究開發(fā)的新型內(nèi)生菌，未來研究及應(yīng)用的的主要方向包括：

（1）定殖策略研究方面：印度梨形孢能夠和12個科的植物建立共生關(guān)系，與其他科植物的定殖研究仍需要深入探討，擴(kuò)大印度梨形孢的應(yīng)用范圍；此外，土著微生物組具有優(yōu)良的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中具有無限前景。印度梨形孢的存活和維持等功能是發(fā)揮應(yīng)用效果的關(guān)鍵。綜合宿主和印度梨形孢的生態(tài)學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)的框架，研究印度梨形孢的定殖策略尤為重要。

（2）印度梨形孢-植物互作機(jī)制方面：印度梨形孢促進(jìn)植物生長發(fā)育的作用機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步的研究。比如利用基因工程法、理-化-生耦合技術(shù)、組學(xué)方法等綜合研究微生物-植物相互作用機(jī)制，發(fā)掘、證明微生物-植物相互作用的分子機(jī)理，為微生物的應(yīng)用提供基礎(chǔ)支撐。這些先進(jìn)技術(shù)，包括宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、宏代謝組等技術(shù)在細(xì)菌機(jī)制研究中逐漸得到重視，然而在印度梨形孢-植物互作機(jī)制方面仍然需要加強(qiáng)。

（3）印度梨形孢相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用方面：菌體的保存和復(fù)蘇往往限制著印度梨形孢的應(yīng)用，未來需要不斷開發(fā)新技術(shù)，提高印度梨形孢保質(zhì)期和存活期。其次，印度梨形孢在田間試驗(yàn)使用時往往不能重現(xiàn)預(yù)設(shè)效果，這通常是由于室內(nèi)和室外環(huán)境的差異導(dǎo)致目標(biāo)微生物的野外生存能力不足。為了克服這一點(diǎn)，將印度梨形孢和亞硫酸鹽鎂混合，制成“Rootonic”配方，提升了植物產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量。類似產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用及商業(yè)化仍在進(jìn)行中。在未來的農(nóng)業(yè)實(shí)踐中使用印度梨形孢作為生物菌劑改善土壤質(zhì)量和促進(jìn)植物生長發(fā)育，還應(yīng)關(guān)注真菌在環(huán)境中的存活的持久性、菌劑配方和穩(wěn)定性和產(chǎn)業(yè)化的制造加工等問題。最后，一些PGPR雖然對植物表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用，但對人體健康會產(chǎn)生潛在安全威脅，這也是PGPR在應(yīng)用中需要考慮的問題。