克氏原螯蝦微小桿菌Exiguobacterium profundum的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

石瑞雪，李艷和

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

0 引言

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，俗稱淡水小龍蝦。原產(chǎn)于美國南部和墨西哥北部，20世紀(jì)30年代由日本傳至中國南京一代[1]，因?yàn)槠溥m應(yīng)性廣，繁殖力強(qiáng)，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，市場(chǎng)前景好，各地迅速掀起了人工養(yǎng)殖克氏原螯蝦的熱潮，養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅速。然而，由病原體侵襲和非病原體因素的影響而爆發(fā)的疾病問題仍然給廣大養(yǎng)殖者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其中，病原體的侵襲主要包括細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲性疾病；非病原體因素的影響主要包括水環(huán)境的改變和食物短缺造成克氏原螯蝦互相殘殺，以及藥物殘留、消毒不徹底等多種因素造成的克氏原螯蝦中毒現(xiàn)象[2]。目前研究較多的對(duì)克氏原螯蝦具有致病性的病原有氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[3-4]、豚鼠氣單胞菌(Ameromonas caviae)[5]和維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[6]，檸檬酸桿菌屬的弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)[7]與布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)[8-10]，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)[11]，異常嗜糖氣單胞菌(Aeromonas allosaccharophila)[12]和白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)[13-14]。這些致病性病原的研究對(duì)于克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。為了能夠?qū)ξr病進(jìn)行有效的預(yù)防和治療，對(duì)于克氏原螯蝦病原的進(jìn)一步鑒定尤為重要。

微小桿菌屬(Exiguobacterium spp.)是一種具有廣闊生境分布的革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在環(huán)境生物修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮作用[15]。據(jù)報(bào)道，Exiguobacterium aurantiacum可能與凡納濱對(duì)蝦肝胰腺壞死癥有關(guān)[16]，Exiguobacterium indicum是原料小龍蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[17]，Exiguobacterium profundum最早發(fā)現(xiàn)于深海熱液口，中度嗜熱，具有耐鹽性[18]。筆者從瀕死克氏原螯蝦肝胰臟中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16srRNA基因序列測(cè)定，鑒定該菌為Exiguobacterium profundum，進(jìn)行了回歸感染實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分離菌所用克氏原螯蝦來自湖北省洪湖市某養(yǎng)殖場(chǎng)；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；淀粉水解培養(yǎng)基、盧戈氏碘液、SIM培養(yǎng)基、氧化酶試紙、3%過氧化氫酶試劑、硝酸鹽肉湯、硝酸鹽還原試劑盒、蔗糖發(fā)酵管、甲基紅、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、VP甲液、VP乙液和明膠生化管購自青島海博生物有限公司；NaCL和胰蛋白胨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Premix TaqTM購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DL 2000 DNA Marker購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離與純化

取克氏原螯蝦用生理鹽水反復(fù)沖洗體表3～5次后放在無菌培養(yǎng)皿中，于超凈臺(tái)中解剖取出肝胰腺，用接種環(huán)蘸取肝胰腺后于營養(yǎng)瓊脂平板劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取單一形態(tài)菌落反復(fù)劃線，直至長出大小形態(tài)一致菌落。將分離純化得到的單一形態(tài)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中增殖備用，分離純化的細(xì)菌平板保存于4℃。將純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢觀察。

1.3 生理生化鑒定

使用一次性接種針挑取單個(gè)菌落，涂于氧化酶試紙，30 s內(nèi)觀察顏色變化。按照說明書配置SIM培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基和磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基。將分離菌株接種于上述培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑于SIM培養(yǎng)基表面，靜置10 min觀察現(xiàn)象；滴加盧戈氏碘液于淀粉水解培養(yǎng)基中的菌落觀察顏色；滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)箱孵育2 h后觀察顏色；滴加甲基紅1滴于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基觀察顏色。將菌株接種于不同濃度NaCl胰胨水(0%、3%、6%、8%、10%、12%)、明膠生化管、硝酸鹽肉湯和蔗糖發(fā)酵管，按照說明書要求進(jìn)行培養(yǎng)并觀察。上述每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行。

1.4 16s rRNA基因序列分析

超凈臺(tái)中使用無菌接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基中單一菌落，置于加入150μL無菌雙蒸水的1.5 mL無菌離心管內(nèi)，并將其置于100℃中煮沸10～15 min，冷卻后放入離心機(jī)中，12000 r/min，離心10 min，取上清液為細(xì)菌DNA模板，保存于-20℃冰箱中。

使用16srRNA通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT3’進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25μL，Premix TaqTM12.5μL，上下游引物各1μL，模板2μL，滅菌雙蒸水8.5μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送擎科生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI Blast進(jìn)行序列比對(duì)，并使用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌16s rRNA基因序列通過NCBI進(jìn)行Blast同源序列分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在Genebank中獲取與分離菌為同一屬的菌種16srRNA基因序列，并獲取大腸桿菌16s rRNA基因序列作為外源菌，在MEGA 7中采用ClustaLW進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用鄰接法(Neighbor joining method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，并通過1000次的自舉分析(Bootstrap)以檢測(cè)置信度。

1.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

使用涂布器將100μL 0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木壕鶆蛲坎加谄胀↙B固體培養(yǎng)基，使用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，每種藥敏紙片做3組平行。正面放置3 min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 人工感染實(shí)驗(yàn)

將保存于LB液體培養(yǎng)基的菌液解凍后取部分菌液接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化并繁殖。將菌液稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，使用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用0.65%無菌生理鹽水將菌液稀釋為5個(gè)梯度的菌懸液進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)：108、107、105、103、101。選取四肢健全、活力好的克氏原螯蝦，每組10尾，2個(gè)平行組，在第二腹節(jié)處肌肉注射100μL菌液，對(duì)照組注射100μL 0.65%無菌生理鹽水。感染后觀察7天，期間每天定時(shí)投喂1次，并及時(shí)換水吸污保持水質(zhì)，對(duì)瀕死的克氏原螯蝦進(jìn)行細(xì)菌的再分離及鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)處理和分析

藥物敏感實(shí)驗(yàn)測(cè)得抑菌圈直徑及7天人工感染實(shí)驗(yàn)過程中克氏原螯蝦死亡數(shù)目采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖表繪制。測(cè)得抑菌圈直徑數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，并參照杭州微生物試劑有限公司的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感性判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌形態(tài)特征

從克氏原螯蝦肝胰臟中分離純化得到一株黃色隆起、邊緣不整齊的圓形形態(tài)菌株（圖1）。經(jīng)革蘭氏染色為陽性菌（圖2），命名為W菌株。

圖1 在LB培養(yǎng)基生長的分離菌W菌落形態(tài)

圖2 分離菌株W革蘭氏染色結(jié)果

2.2 生化鑒定結(jié)果

參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1，分離菌W生化特性與微小桿菌E.profundum一致，初步鑒定為E.profundum。

表1 分離菌株W的生理生化特性

2.3 細(xì)菌16s rRNA分子鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到W菌株的16srRNA片段，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)其長度約為1400 bp長度片段（圖3）。將基因序列通過NCBI進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示E.profundum與該菌同源性大于99%。通過Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)該菌與E.profundum聚為一個(gè)分支（圖4），結(jié)合該菌的生理生化鑒定結(jié)果將其鑒定為E.profundum。

圖3 分離菌株16srRNA擴(kuò)增結(jié)果

圖4 W菌株基于16srRNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 藥敏特性

分離菌株W的藥敏特性詳見表2。菌株W對(duì)青霉素G、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙氟哌酸、萬古霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、痢特靈、氯霉素、克林霉素30種藥物均敏感。

表2 分離菌株W藥物敏感結(jié)果（杭州微生物試劑有限公司）

續(xù)表2

2.5 人工感染

經(jīng)過人工感染后的克氏原螯蝦出現(xiàn)部分死亡，其死亡情況如表3所示。分離菌株W感染克氏原螯蝦后其死亡率與感染濃度不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，對(duì)照組也出現(xiàn)死亡情況。對(duì)瀕死蝦肝胰腺進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，從感染蝦肝胰腺中均分離得到E.profundum，從對(duì)照組瀕死蝦和感染組瀕死蝦肝胰腺中均分離到弗氏檸檬酸桿菌，但對(duì)照組未分離到E.profundum。

表3 分離菌株W感染克氏原螯蝦后的死亡率

3 結(jié)論

本研究從瀕死克氏原螯蝦肝胰腺分離出優(yōu)勢(shì)菌株W，經(jīng)過革蘭氏染色為陽性菌，對(duì)該菌生理生化特性進(jìn)行鑒定，該菌過氧化氫酶陽性，能夠還原硝酸鹽，氧化酶、硫化氫、吲哚、V-P、甲基紅陰性，不能水解淀粉，具有耐鹽性，能夠在0%～12%NaCl胰胨水中生長，與E.profundum生理特性一致[15]。生理特性鑒定結(jié)果結(jié)合16sRNA序列比對(duì)結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果確定該分離菌為E.profundum，屬于微小桿菌屬。該菌對(duì)青霉素G、氨芐西林、頭孢氨芐等30種抗菌藥物均敏感，回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其可能參與克氏原螯蝦的致病過程。

4 討論

克氏原螯蝦具有極強(qiáng)的繁殖力、環(huán)境適應(yīng)力，風(fēng)味獨(dú)特，受到人們的廣泛喜愛，自傳至中國起，逐漸成為中國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類，其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，至2020年其產(chǎn)量已超過239萬t。伴隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，其病害的發(fā)生也變得頻繁[19]。目前對(duì)于其病原的研究主要集中在氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬細(xì)菌及白斑綜合癥病毒[20]，本研究首次報(bào)道從瀕死克氏原螯蝦肝胰腺中分離出微小桿菌E.profundum。

微小桿菌屬是具有耐熱/冷性、耐堿性、耐鹽性等獨(dú)特性質(zhì)的一類革蘭氏陽性菌[21]，目前對(duì)于該菌屬的研究主要集中于其對(duì)環(huán)境污染的生物修復(fù)中[22-24]，關(guān)于其對(duì)生物致病性相關(guān)的報(bào)道較少。E.profundum首次發(fā)現(xiàn)于深海熱液口[18]，具有耐鹽性，在本研究生理生化特性的耐鹽性實(shí)驗(yàn)中，其在12%NaCl胰胨水中仍可生長，但生長狀況不如較低濃度。基于16s rRNA基因序列進(jìn)行細(xì)菌鑒定是一種常用的有效工具，本研究通過擴(kuò)增獲取分離菌16srRNA基因序列，將其在NCBI中進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與E.profundum同源性最高。通過NCBI獲取微小桿菌屬菌種16s rRNA序列，并以大腸桿菌作為外源菌與分離菌16s rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果顯示其與E.profundum聚為一支。結(jié)合生理特性鑒定結(jié)果可確定該分離菌為E.profundum，屬于微小桿菌屬。

本研究使用E.profundum對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行回歸感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，感染組與對(duì)照組克氏原螯蝦均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。經(jīng)過對(duì)瀕死蝦進(jìn)行細(xì)菌的分離純化與鑒定，發(fā)現(xiàn)感染組除分離到E.profundum外，另分離到弗氏檸檬酸桿菌；對(duì)照組同樣分離到弗氏檸檬酸桿菌，未分離到E.profundum。弗氏檸檬酸桿菌具有致病性，能感染克氏原螯蝦、羅非魚、加州鱸、虹鱒等多種水生生物[25-28]?；貧w感染實(shí)驗(yàn)中克氏原螯蝦的死亡可能與弗氏檸檬酸桿菌有關(guān)，E.profundum可能參與致病，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

抗生素是目前防控細(xì)菌性疾病的重要手段[29]，本研究使用30種藥物對(duì)其耐藥性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)青霉素G、氨芐西林、頭孢氨芐、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾明等30種藥物均敏感，為該菌的防治提供了理論依據(jù)。該菌對(duì)藥物較敏感，但在養(yǎng)殖種防治疾病仍需要根據(jù)具體情況對(duì)癥下藥，防止抗生素濫用，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[6]。